CRISPRCas9系统原理应用及发展

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,CRISPRCas9系统原理应用及发展,1 CRISPR-Cas,概述,1987年，日本大阪大学Osaka University在对一种细菌编码的碱性磷酸酶alkaline phosphatase基因进展研究时，发如今这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。,以后，研究者们在包括?science?和?nature biotechnology?等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现准确的基因修饰。,1 CRISPR-Cas,概述,CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进展修饰的技术。,CRISPR-Cas主要由两局部组成：,识别,切割,1 CRISPR-Cas,概述,1.1 CRISPR构造,CRISPR：,clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常 2148 bp,重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列space与靶基因进展识别。,1.1 CRISPR构造,1.2 Cas,家族,CasCRISPR associated：,存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进展切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2 CRISPR-Cas,系统的发现,CRISPR-Cas是很多细菌和大局部古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进展特异性的识别，利用Cas蛋白进展切割，从而到达对自身的免疫。,2 CRISPR-Cas,系统的发现,2 CRISPR-Cas,系统的发现,2 CRISPR-Cas,系统的发现,CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列spacer决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列spacer来实现的。,2 CRISPR-Cas,系统靶向要求,最主要的要求：,PAMprotospacer-adjacent motif为NGG。,2 CRISPR-Cas,系统靶向要求,在人类基因组中，平均每,8bp,就出现一个,NGG PAM,。,2 CRISPR-Cas,系统靶向要求,3 CRISPR-Cas,系统介导基因修饰,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板交换,年1月29日在?nature biotechnology?上发表的?RNA-guided editing of bacterial genomes using,CRISPR-Cas systems?一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板交换的相应基因来到达基因的定向修饰。,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板交换,3.2 sg-RNA,：,Cas,介导基因修饰,年1月29日在?nature biotechnology?上发表的?efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system?一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进展修饰。,3.2 sg-RNA,：,Cas,介导基因修饰,3.2 sg-RNA,：,Cas,介导基因修饰,3.2 sg-RNA,：,Cas,介导基因修饰,Cas9,sg-RNA,年2月15日在?science?上发表的?Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems?一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进展编辑。,3.3 cr-RNA,：,Cas,介导双基因修饰,3.3 cr-RNA,：,Cas,介导双基因修饰,4 CRISPR-Cas,系统前景分析,这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。,4 CRISPR-Cas,系统前景分析,年4月12日在?cell stem cell?上发表的?Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs?一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进展修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。,4 CRISPR-Cas,系统前景分析,而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要交换20个核苷酸就行。,4 CRISPR-Cas,系统前景分析,只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。,编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。,较短的sgRNA序列也防止了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。,技术优势,