ELISA产品简析与探讨

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,ELISA产品简析与探讨,二,.,术语,抗体？为何能测定小分子？,抗体Antibody，又称免疫球蛋白Immunoglobin，Ig，是一种免疫系统中鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质。仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。“钥匙与锁的关系,以克伦特罗试剂盒为例：,包被板：包被有以半抗原克伦特罗经过偶联后免疫所获得的多克隆抗体；该抗体可以识别克伦特罗或者其类似物,Anti-cle抗体：通过共价结合或非公价吸附到微孔板到达固相化目的Coating techniques,单克隆抗体技术和多克隆抗体技术比较分析：,特别说明：,不同的技术平台上应用的原料虽然名称一致比方克伦特罗的酶标和金标抗原抗体原料，但抗体的来源属性可能是不一样的。,某抗体适合做酶标产品，但是可能不适合做金标产品。,单抗技术,特征,名称,单克隆抗体,monoclonal antibody,多克隆抗体,polyclonal antibody,产生,1,种抗原决定簇,+1,个效应,B,细胞杂交瘤（增殖,+,分泌特异性抗体）,多种抗原决定簇,+,效应,B,细胞,或 同一种抗原决定簇,+,不同的效应,B,细胞,特征及优点,高特异性、高均一性；批间,CV,小；广泛应用,ELISA,、,WB,、,IP,、,IF,、,ICC,、,IHC,（抗体的用量比较大或者需要长期使用一致的抗体）,制备时间短、首次制备成本低，特异性和灵敏度取决于制备技术；识别多个抗原表位（不会影响实验结果）；利用,ELISA,法可以检测类似物,缺陷,不能进行沉淀和凝集反应；反应强度不如多克隆抗体；制备技术复杂而且费时费工；无法进行多合一检测；,（对于某些药物的代谢物检测上可能存在假阴性）,批间,CV,大；,交叉反应率高（特异性不强）,检测下限和灵敏度,试剂盒灵敏度：,试剂盒本身的灵敏度和对某一具体样本的检测限是不一样的。试剂盒本身的灵敏度一般是指试剂盒标准品中除零标准外浓度最小的标准品浓度值。其理论定义为：测定10孔B0吸光度值，算出平均值X和标准偏差SD，计算出3倍SD值，据公式X+3SD X+3SD 得出的结果即为试剂盒灵敏度一般招投标资料上要求的灵敏度即指标准曲线浓度最小值,针对样本的检测下限：,其理论定义为：按照合理的前处理方法对20个阴性样本进展测定，算 出平均检测值X和标准偏差SD，计算出3倍SD值，据公式X+3SD得出的结果即为该样本的检测下限。,注：,文件引自农业部备案文件2021,杭州迪恩,克伦特罗,EIA,IC50,半对数曲线,Cubic spline,拟合,中监所备案采用,试剂盒灵敏度和检测下限与曲线的关系：,1.IC50是什么？,以竞争法为例：系指,在酶免反响中药物产生,50%抑制率时所对应,的药物标准品浓度.,2.灵敏度怎么表示比较,好？,用IC50值表示使用,标准曲线浓度最低点表,示缺少统一标准且混乱,3.灵敏度和检测(下)限,的关系?,一般地，灵敏度越高，,检测限也就越高。在设定,判断阈值判断阴性阳性,值时，阈值应可能落在,曲线斜率较大处即形状,较陡处；靠近IC50值,招标资料上的,所谓灵敏度,相关系数,对数曲线,半对数曲线，线性拟合,大多数,EXCEL,软件就是使用该曲线算法,相,关,系,数,变异系数CV：,表达试剂盒的稳定性和准确性。CV=SD/X 100%,相关系数 Correlation coefficient:,在概率论和统计学中称相关系数或关联系数。显示两个随机变量之,间线性关系的强度和,方向。,试剂盒备案要求：,曲线拟合方式：,1.线性方程,2.四参数,3.Cubic spline,特异性穿插反响率,药物的穿插反响率：,定义：,引起50%抑制的标准物浓度与类似物引起50%抑制的浓度值之比。,比方客户问：克伦特罗试剂盒/检测卡对莱克多巴胺有没有穿插能不能测?,计算公式：=IC50CL/IC50Rac100%,意义：,类似物的穿插反响率参数表达试剂盒特异性。,物质名称,交叉反应率（）,Ractopamine,100.0,(1R,3R)-ractopamine,489.0,Ractopamine glucuronide C,384.0,(1S,3R)-ractopamine,134.0,Dobutamine,5.3,Ritodrine,3.6,Ractopamine glucuronide B,3.1,(1S,3S)-ractopamine,1.9,Ractopamine glucuronide A,1.0,(1R,3S)-ractopamine,0.9,Bamethane,0.3,Isoxsuprine,0.2,Salmeterol,0.2,Fenoterol,0.1,Clenbuterol,0.01,Salbutamol,0.01,试剂盒检测限：,1.检测限的意义：对某一具体药物和具体样本来说，并非试剂盒的灵敏度越,高越好，理想的状态是检测范围的中间值与该药物在某一样本的“超标值或,“阳性值接近，既可以减少误差又方便客户使用即阈值和IC50接近,2.样本差异性：结合样品前处理的实际情况，由于方法局限或者杂质因素干扰时需具体分析。比方，某一试剂盒本身最低检测限为0.05ppb,而对尿样的检测限可能是0.15ppb,牛奶为0.15ppb,虾产品为0.25ppb,饲料为15ppb。,3.方法差异性：不同方法检测限也可能不一样方法检出限，不同厂家的试剂盒检测限也可能不一样。,以克伦特罗试剂盒为例：,假阳性：,非目标成分在酶联吸附体系中的的总和。,假阴性：,在方法符合实际的情况下，对目标成分未产生响应或者响应不明显。,试剂盒可以允许一定程度的假阳性，但是不允许假阴性的存在。,举例：,双聚集团技术中心 质控标准要求：,克伦特罗ELISA试剂盒：假阴性率0%假阳性率0%,克伦特罗金标试纸条：假阴性率0%假阳性率3%,补充资料?如何区分瘦肉精检测卡好坏?:,一般性招投标资料对假阳性假阴性的要求,三.不同反响原理ELISA试剂盒的特点比较,直接竞争法试剂盒特点：,1.原理简单：抗原抗体反响一步法，时间短；,2.试剂构成简单；3个核心组分见右图,显色剂采用国外最新技术，代替国内的A/,B液，同时提高对HRP的灵敏度和稳定性；,3.加样步骤少且加样模式较统一，操作简,单且：50ul样本+100ul酶标物+100ul,显色剂+100ul 终止液；,4.采用高灵敏度，高亲和力的抗体，决定,检测分析时间短；20分钟；且采用进口的,高吸附力的聚苯乙烯微孔材料固相化抗体,，提高试剂盒稳定性，确保检测分析准确。,5.间接竞争法试剂盒特点：,1.原理相对直接竞争法要复杂，二步,法；反响时间长，但可以变换为一,步法反响,2.试剂构成成分多：5个核心组分,3.加样步骤多，试剂盒组分多，易出错，,反响时间较长一般至少50分钟,4.显色剂：国产试剂盒根本均采用A/B,液，增加了加样量和试剂的复杂度,抗体包被板,显色剂,二合一,酶标抗原,冻干粉,抗原包被板,酶标二抗,显色剂,A液,B液,抗体工作液,直接法,间接法,杭州迪恩,北京勤邦,试剂盒,操作图解,酶标抗原,标准品,/,样品,参加标准品/样品和酶标物,温育,洗板,显色,终止,显色剂,读数,直接竞争法试剂盒比较？,抗体包被板：进口高吸附力聚苯乙烯材料，抗体固相化更稳定，采用高灵敏度多抗，确保试剂盒灵敏度,酶标物冻干粉技术：确保酶标物在运输中和保存中的稳定性，即溶即用型,反响时间：“10分钟+10分钟 模式,混合显色剂：对HRP响应快，二合一，使试剂盒操作更方便，但瓶子的材质会影响其稳定性,加样模式的统一化：50ul样本+100ul酶标物+100ul显色剂+100ul终止液,联机软件：数据处理联机化，按“start键既出分析报告,抗体包被板,显色剂,二合一,酶标抗原,冻干粉,抗体包被板,酶标抗原,浓缩液,显色剂,A液，B液,直接法,直接法,显色剂,TMB with a red indicator,直接法,酶标物浓缩液,抗体包被板,杭州迪恩,德国拜发,华安麦科,直接竞争法试剂盒的稳定性优势,决定稳定性的关键组分优势：,采用进口的高吸附力的聚苯乙,烯微孔包被多克隆抗体：固相,化效果和稳定性要胜于一般单,抗、包被抗原和国产的低吸附,微孔板系列,酶标物：采用冻干粉形式，直,接消除酶标物在运输中的不利,因素，溶解之后在28度仍然,稳定。,显色剂含有特殊的稳定剂确,保显色剂不变质,?关于加强兽药残留检测试剂(盒)管理,的通知?(农办医 2005 3号),直接竞争法试剂盒的稳定性上应本卷须知,1.存储与使用：,储存：低温2-8，忌冷冻。未使用完的试剂盒注意拉紧铝箔袋封口以防止板条受潮失效,使用：回温后于室温252环境下使用,反响：反响中防止阳光直射、空调或风扇直吹。,2.标准操作包括前处理：熟读产品说明书,四,.,药物代谢动力学简述,样品,尿液,肌肉,肝脏,眼球,含量,10,80,ng/ml,6.1,ng/g,39,ng/g,118 ng/g,与血浆的比例,40,倍,315,倍,2090,倍,107,倍,资料引自：吕燕，鲍伟华，余晓华，等.GCMS法研究猪体内克仑特罗的残留消除规律J中国兽药杂志，2021，43(11)26-29,另例：莱克多巴胺的药代学规律,莱克多巴胺作为瘦肉精的替代品，滥用趋势明显上升。在莱克多巴胺的检测中，常常会遇到这样的现象：用ELISA检测阳性的样品，用色谱法确证时却都为阴性，而且检测结果大相径庭。不同ELISA试剂盒的检测结果也相差很大。,1.莱克多巴胺的快速代谢特性 莱克多巴胺在动物体内不能稳定存在，会快速代谢，国外资料说明，在停药3天后，动物体内的莱克多巴胺原药残留量将很低，而以代谢物的形式存在动物体内。莱克多巴胺的代谢物主要有三种：莱克多巴胺葡萄糖甘酸A、莱克多巴胺葡萄糖甘酸B、莱克多巴胺葡萄糖甘酸C，而三种代谢物的比例是不确定的。举例说明：如果给一头猪喂添加莱克多巴胺的饲料，在停药第0天尿样中的莱克多巴胺残留浓度为20ppb，第3天后，莱克多巴胺残留浓度将19ppb。,2.莱克多巴胺的正确检测方法,根据上述，要准确检测莱克多巴胺的残留量有两个选择：A：除检测莱克多巴胺外，增加对莱克多巴胺代谢物的检测。B：在检测前，用酶解的方法将莱克多巴胺代谢物复原成莱克多巴胺原药，再检测莱克多巴胺的含量。但酶解需要16小时。对于ELISA试剂盒，选择A和B都是可能的，但选择A依赖于ELISA试剂盒的穿插反响特性；对于色谱方法，由于主要代谢物有三种之多，选择B更可行和方便。,局部资料引自：,强致懿；?猪肝脏、肌肉、尿液和血液中莱克多巴胺残留检测方法及残留消除的研究?；,文章链接：,五,.,样本前处理浅析,前处理方法目的：测定前排除干扰组分；对样品进展浓缩。原那么：消除干扰因素；完整保存被测组分；使被测组分浓缩；,方法是怎么建立的？有什么依据？,分析药物的化学性质相似相溶原理分析样本的性质和药残的分布规律合理的提取和除杂方法匹配试剂盒体系结合灵敏度和检测限,说明书上的方法是不是固定不变的？,根本原那么不变，可以微调和优化,不同样本的前处理方法是不是可以一样?,样本差异显著的情况下，不同类型样本由于引起的干扰不同，在方法设计上存在区别,克伦特罗,前处理方法sample treatment,方法的选择性问题：,在动物组织多残留检测方法研究中，生物样品成分复杂，怎样到达消除非目标成分的干扰且尽可能的 完整保存被测组分；那么最关键的一环取决于前处理。前处理决定着方法的灵敏度和别离度，在整个试验过程中占据着90%甚至更多的工作量。,样品前处理一般分为提取、净化、浓缩和衍生化4个局部,方法的建立思路：,分析兽残分子的理化性质和残留规律,根据相似相溶和 2个原那么：消除干扰因素 完整保存被测组分 对于ELIS