RNA的提取琼脂糖电泳及RTPCR

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/4,（8：008：05）,实验回顾,实验一、基因组DNA的提取、 酶切及电泳,2020/11/4,1,目的 DNA片段,质粒,TA载体,连接,重组质粒,目的 DNA,转化,无质粒的E.Coli 死亡,有质粒的E.Coli 存活,含抗生素培养基中生长,PCR,2-3min,平板筛选,2020/11/4,2,实验二 RNA提取、逆转录PCR,实验内容,1、小鼠肝脏组织总RNA的提取；,2、RNA的琼脂糖凝胶电泳；,3、以总RNA为模板的逆转录反应；,4、以cDNA为模板的特定基因的RT-PCR:,注：本次实验扩增GAPDH基因(746bp),5、 PCR产物的电泳及回收,（8：058：15）,教师要有下午电泳时 播放的多媒体 PCR Flash 动画 PCR在法医学上的应用,2020/11/4,3,RNA提取操作注意事项,RNA分离的关键因素是减少RNA酶污染。,RNA酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。RNase耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。,1、尽量避免外源性RNase 污染,a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。,b. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）,c.一次性塑料器材最好是新开封并经过DEPC水处理及高压灭菌。,d.玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻,璃器材还应该进行高温烘烤。,2、应用RNase 抑制剂抑制内源性RNase 活性,。,2020/11/4,4,总RNA,真核细胞的RNA主要分为：,1、mRNA,:,1-5%,起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。,5鸟嘌呤7位甲基化CH,3,修饰。,1）免受核酸酶破坏，,2）起始、促进蛋白质合成。,3poly(A)尾巴结构 20-200个A. 翻译所必需。,2、tRNA,:,10-15%,3、rRNA,:,80-85%,大亚基60S:,28S,=4718nt 5S=120,nt,5.8S=160,nt,小亚基40S:,18S,=1874nt,2020/11/4,5,1）将1 ml Trizol 试剂分装到Eppendorf 管中备用。,2）,实验教师操作:,取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨,要彻底,。,3）将研磨后的组织（,小米粒大小,）转移至1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。,4）室温孵育10 min。,（8：159：05）,发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。,强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。,第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA,2020/11/4,6,1、异硫氰酸胍法：,GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。,特点：需低温操作，但价格经济。,2、Trizol 试剂,（商品化产品）,特点：在室温下可以提取细胞总RNA，,具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。,3、mRNA提取试剂盒,真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。,课间介绍 RNA提取的几种方法,室温孵育10 min,2020/11/4,7,RNase抑制剂介绍,1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐,RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。,使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中,所有液体试剂都应该用DEPC处理。,有效浓度：0.05%-0.1%，室温磁力搅拌20分钟。,灭活条件：高压消毒，或70,C 1 h。,在Tris溶液中半衰期为1.25min。,储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4,C ，或液氮中。,2、肝素,使用浓度：0.110mg/ml,效 果: 37,C 时，可抑制95%的RNase 活力。,如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制 效果。,2020/11/4,8,室温孵育10 min 结束,5）加入200,l氯仿，震荡混匀20-30 s，室温放置5 min,（此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）,10, 000 rpm，离心 5 min (统一离心),7）将清澈透明的,上层水相,转移至另一离心管中。,9：0510：05,RNA (清澈透明),DNA,Protein,第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA,2020/11/4,9,RNA提取:,RNA (清澈透明),DNA,Protein,2020/11/4,10,8）沉淀RNA：加0.5 ml,异丙醇,，上下颠倒混匀，室温,10 min,。,10, 000,rpm，4,C，(统一) 离心10 min，弃上清。,10）加,1ml 75%乙醇,洗涤。,11）7500rpm，4,C 离心 1 min，弃上清,再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。,在用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行，当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，而且尽可能快地进入下一个环节。,离心10分钟时课间休息,注意：,75%乙醇的作用：,不起沉淀作用，只是为了清洗管壁,加入方法一定是,贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀,2020/11/4,11,12）室温干燥35 min（根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此,步骤非常关键,。）,注意事项,：,RNA:,自然室温干燥,避免放在37oC孵箱中过度干燥以防无法溶解。,RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因 。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状。,RNA pellet：,乳白色，透明胶样,干燥后无色透明,2020/11/4,12,13）用加样器吸取冰冷DEPC-H,2,O,18,l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA 沉淀。,溶解的RNA应置冰上保存,。,14) 吸出 9,l溶液放到冰上备用(将用于电泳).,15) 剩余 9,l溶液,放到冰上备用（用于,RTPCR,）.,RNA的溶解：,注意：,RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，,一定,要用加样器,反复,多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。,避免气泡的方法：,用加样器的第一挡,每次吹打都不要打出气体,判断溶解程度：,吹打时液体流动不拐弯为止。,2020/11/4,13,逆转录酶：,存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37,o,C，禽类型42,o,C 。,以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。,RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。,RT第二部分：逆转录反应 (RT),AAAAAA(n),mRNA,AAAAAA(n),3,-,TTTTTT(18)-5,68-70,o,C, annealing,AAAAAA(n),3,-,TTTTTT(18)-5,37-42,o,C, RTase,mRNA,mRNA,cDNA,10min,1-2h,RT,2020/11/4,14,按照下列配方进行RNA的RT反应：,第一步：,总RNA,9,l,Oligo dT (0.05,g/ml),1,l,(终：2.5 ng/ml),轻弹管底混合，,置,65,水浴10min,后,，,立即冰浴2min,。,在水浴10分钟时，开始RNA电泳。,2020/11/4,15,RT引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。,关键点：,RNA是否充分溶解,根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用1ml Trizol试剂提取出来的总RNA适合于20,l体积的逆转录反应体系。,引物的量是否合适,高温退火避免Oligo dT锚锭点错误，同时，打开RNA链之间的二级结构，利于RT。,退火后一定迅速放在冰上,在水浴10分钟时，开始RNA电泳。,2020/11/4,16,将,RNA 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳,9,l,RNA 样品,23,l,上样液轻轻混匀，,上样,电泳: 120伏，1020分钟,注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！,琼脂糖凝胶要新鲜配制！,紫外透射仪观察电泳结果,2020/11/4,17,RNA电泳结果,rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。,RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为,在电泳过程中RNA可能发生降解,。,重点讲解28S、 18S和5S的比例。,2020/11/4,18,分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。,RNA电泳结果分析,2020/11/4,19,第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：,5,RT-buffer 4,l,RNasin (40U/ml) 1,l,dNTPs (10mmol/L) 4,l,AMV 1,l,轻弹管底混合，可用离心机甩一下。,置42,o,C 水浴1h。,将上述反应移至68,o,C水浴10min以灭活,RTase，并冰浴，保存备用。,（10：3011：30 由老师结束实验，放-20,o,C，下午使用 ）,2020/11/4,20,cDNA,4,l,10,PCR buffer（含MgCl2） 5,l,dNTPs (10mmol/L) 1,l,5引物 (10,mol/L) 1,l,3引物 (10,mol/L) 1,l,去离子水,（补足反应体系）,39,l,Taq DNA pol. (2U/,l) 1,l,轻弹管底混合（用离心机甩一下）,注意：最后加入Taq 酶。,PCR 操作,50,l,在一微量离心管中,依次,加入下列试剂：,2020/11/4,21,PCR仪设定的反应条件：,94,o,C 45 S DNA变性,55,o,C 45 S DNA复性,72,o,C 1 min 产物链延伸,25-30个循环后 72,o,C 10 min,根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR。,2020/11/4,22,PCR仪介绍：,如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；,如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。,PCR反应期间讲解： 1：203：00,2020/11/4,23,PCR仪内发生的反应,2020/11/4,24,2020/11/4,25,1）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情,况时，一定要防止污染，尤其是PCR产物的污,染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可,少的。,2）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板,退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模,板结合，因此，适量模板量是非常重要的。,模板过多还能大量消耗镁离子。,PCR反应注意事项：,2020/11/4,26,根据待扩增基因片段的大小确定,延伸,时间，小于500bp，一般采用1分钟即可，大于500bp，可采用2分钟，但一般超过2000bp，一般可适当延长延伸时间2-3分钟。,变性,温度一般选用94,1,o,C，变性时间可根据模板大小和浓度确定，一般采用30秒。,退火,温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和GC含量有关。,引物长度一般在15-25bp之间。,Tm=4(G+C)+2(A+T),如何确定PCR的变性、退火和延伸温度和时间？,2020/11/4,27,RT的引物选择：,Oligo (dT),15-18,Specific anti-sense primer,Random primer,因为基因序列与mRNA序列是一致的。,病毒RNA作为RT模板时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链RNA病毒？负链RNA病毒？,正链RNA病毒：RT引物用anti-sense primer；,负链RNA病毒：RT引物用sense primer。,2020/11/4,28,1.为什么要加入镁离子？,镁离子是Taq DNA聚合酶的辅酶，,2.0,mM的浓度时酶活性最高。镁离子能够和负离子集团结合，在PCR反应中，模板DNA、引物DNA、dNTP均可和镁离子结合，尤以dNTP影响最大。一般镁离子应比dNTP高0.5-1.0mM。,2.dNTP的浓度对PCR有什么影响？,dNTP浓度过高，除容易引起碱基错配外，还可结合镁离子。,3.为什么有时候需要进行热启动？,热启动就是让,DNA,在变性温度下开始，,Taq DNA,聚合酶在,DNA,双链充分打开之后再加入,PCR,反应体系中，这样可以保证模板,DNA,变性充分，引物结合顺利并特异。,PCR反应相关问题：,2020/11/4,29,4、DNA聚合酶：,1）Taq DNA聚合酶的特性:,半衰期：95,o,C ，40分钟,活 性：5-3方向的聚合酶活性。,5-3外切酶活性。,缺乏3-5外切酶活性。,因此没有校正功能。,2）Vent,-TM,DNA聚合酶：,半衰期：100,o,C ，95分钟,活 性：还具有3-5外切酶活性。,2020/11/4,30,引物设计,1、GC比值：碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条 氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR退火温度的 重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半。,2、引物特异序列的长度至少为15-18bp。,3、引物的方向：引物的方向永远是5,3方向，正向（Sense）引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向（Antisense）引物则与这股模板DNA序列相互补。,4、 引物的酶切位点：通常在引物的5-端设计适当的限制,性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。,5、引物上启始和终止密码：如果想表达DNA片段，所,用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在,引物的酶切位点之后、特异性DNA序列之前。,6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要,的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。,2020/11/4,31,引物设计方法例：,2020/11/4,32,通常在引物的5-端设计适当的限制性酶切位点,2020/11/4,33,凝胶成像系统：,2020/11/4,34,凝胶成像系统：,2020/11/4,35,播放 PCR Flash 动画,PCR在法医学上的应用,2020/11/4,36,引物的配制：,Primer 1:,OD=5,注意：,计算一管引物的总含量或克分子数,先配成100mM的浓度作为储存液,工作液可以通过稀释获得,如果需要反复应用的引物，配制后一定要分装保存，一段时间后弃掉。,切记：,不要将合成回来的引物一次性配成工作液！,2020/11/4,37,PCR:,PCR的基本流程：,94,o,C, 45 sec,55,o,C, 1 min,72,o,C, 2 min,退火温度的变化是根据引物的GC比例确定或估计的；,退火时间的变化是根据引物的长度调整的。,热启动：,避免发夹结构或其他二级结构影响引物的退火。,两种方式加入DNA聚合酶：,热启动结束后暂停PCR反应，在PCR仪上直接趁热加入DNA pol；,热启动结束后将反应管迅速放在冰上，然后加入DNA pol。,2020/11/4,38,