酶工程 动植物细胞培养产酶

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,1,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 动、植物细胞培养产酶,与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。,动物细胞,获得：离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术等,培养方式：悬浮培养、贴壁培养和微载体培养等,植物细胞,获得：机械捣碎、酶解和诱导愈伤组织的方法,培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等,在次级代谢物的生产过程中通常采用液体悬浮培养。,第一节 植物细胞培养产酶,植物是各种色素、药物、香精和酶等天然产物的主要来源：,目前已知的天然化合物超过,30 000,种,其中,80 %,以上来自于植物,;,从植物中得到的最普遍又必不可缺的药物有,17,类,我国普遍使用的中草药及其制剂,80 %,以上来源于植物,美国每年使用的植物来源的药物超过,30,亿美元,;,全世界每年使用的植物来源的芳香化合物的价值超过,15,亿美元。,研发历史,1902,年,哈勃兰德,( Haberlandt),首次提出分离植物单细胞并将其培养成植株的设想, 100,年来,随着培养基的研制和培养技术的发展,已经从,200,多种植物中分离出细胞,不仅可以通过细胞的再分化生成完整的植株,而且可以通过细胞培养,获得,400,多种人们所需的各种物质。,20,世纪,80,年代以后，植物细胞培养技术迅速发展,已成为生物工程研究开发的新热点。,主要内容,1.,植物细胞的特点,2.,植物细胞,培养,的特点,3.,植物细胞培养的工艺条件及其控制,植物细胞培养的工艺流程,植物细胞培养的培养基,4.,植物细胞培养产酶的工艺过程,一、植物细胞的特点,植物细胞结构,动物细胞模式图,植物、动物、微生物细胞的特性比较,细胞种类,植物细胞,微生物细胞,动物细胞,细胞大小,/um,200,300,1,10,10,100,倍增时间,/h,12,0.3-6,15,营养要求,简单,简单,复杂,光照要求,大多数要求,不要求,不要求,对剪切力,敏感,大多数不敏感,非常敏感,主要产物,色素、药物、香精、酶等,醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等,疫苗、激素、单克隆抗体、多肽药、酶等,三者之间的差异主要有：,植物细胞,动物细胞,微生物细胞。,动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。,植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。,植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。,植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。,植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。,二、 植物细胞,培养,的特点,植物细胞培养技术首先从植物外植体中选育出植物细胞,再经过筛选、诱变、原生质体融合或,D N A,重组等技术而获得优良的植物细胞。然后,在人工控制条件的植物细胞反应器中进行植物细胞培养,从而获得各种所需的产物。,植物细胞培养生产各种天然产物,与从植物中提取分离这些物质相比,具有如下显著特点。,1.,提高产率,2.,缩短周期,植物细胞生长的倍增时间一般为,12,60h,一般生产周期,15,30,天。,3.,易于管理,减轻劳动强度,不受地理环境和气候条件等的影响。,4.,提高产品质量,主要产物的产率较高,杂质较少；,减少环境中有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀；,产物易于分离纯化。,5.,其他,对剪切力敏感、生产周期长等缺点；,许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。,三、植物细胞培养的工艺条件及其控制,（一） 植物细胞培养的工艺流程,一般为：,外植体,-,细胞的获取,-,细胞培养,-,分离纯化,-,产物,1.,外植体的选择与处理,外植体,：指从植株取出,经过预处理后,用于植物组织和细胞培养的植物组织,(,包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等,),片段或小块。,选择,：首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植株,如果植物细胞是用于生产次级代谢物,则需从产生该次级代谢物的组织部位中切取一部分组织,经过清洗,除去表面的灰尘污物。,操作,：将上述外植体切成,0. 5,1c m,左右的片段或小块,用,70 %,75 %,乙醇溶液或者,5 %,次氯酸钠、,10 %,漂白粉、,0. 1 %,升汞溶液等进行消毒处理,再用无菌水充分漂洗,以除去残留的消毒剂。,2.,植物细胞的获取,直接分离法,愈伤组织诱导法,原生质体再生法,直接分离法,:,植物细胞可以直接从外植体中分离得到。分为,机械法,和,酶解法,两种,。,1,）,机械捣碎法分离植物细胞,是先将叶片等外植体轻轻捣碎,然后通过过滤和离心分离细胞。,优点,:,获得的植物细胞没有经过酶的作用,不会受到伤害,;,不需要经过质壁分离,有利于进行生理和生化研究。,缺陷： 由于受到机械的作用,细胞结构会受到一定的伤害,获得完整的细胞团或细胞数量少,其使用不普遍。,2,）,酶解法分离细胞,是利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体,分离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层,而且还能软化细胞壁。,所以,用酶解法分离细胞的时候,必须对细胞给予渗透压保护,如甘露醇等,。,愈伤组织诱导法,愈伤组织,是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团。,通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的,基本过程,:,将选择好含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基加入,0.7 %,0.8 %,的琼脂,制成半固体的愈伤组织诱导培养基。灭菌、冷却后,将上述外植体植入诱导培养基中,于,25,左右培养一段时间,即从外植体的切口部位长出小细胞团,此细胞团称之为愈伤组织。一般培养,1,3,周后,将愈伤组织分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养,以获得更多的愈伤组织。,原生质体再生法,原生质体再生法,:,原生质体,(protoplast),是除去细胞壁后得到的微球体。,植物原生质体的,获得：,可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、器官中获得。,分离方法：,机械分离法和酶解法两种,一般都采用,酶解法,。,酶解法：,植物细胞的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。为使细胞壁降解释放原生质体,必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物质水解的酶制剂,最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。,在原生质体制备过程中,为了防止原生质体被破坏,一般要采用用高渗溶液,以利于完整原生质体的释放。配制高渗溶液的溶质称为渗透压稳定剂。常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。,原生质体分离后,经过计数和适当稀释,在一定条件下进行原生质体培养,使细胞壁再生,而形成单细胞悬浮液。,细胞壁再生后得到的植物单细胞,经过单细胞培养,长成细胞团,再经过继代培养,形成由原生质体形成的细胞系。,3.,细胞悬浮培养,将上述获得的植物细胞在无菌条件下,转入新的液体培养基,在人工控制条件的生物反应器中,进行细胞悬浮培养,获得所需的产物。,4.,分离纯化,细胞培养完成后,分离收集细胞或者培养液,再采用各种生化技术,从细胞或者培养液中将各种物质分离,得到所需的产物。,水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织,外植体,愈伤组织,（二）植物细胞培养的培养基,1.,培养基特点,(1),植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐: P、S、N 、K 、N a、,Ca,、,M g,等大量元素（,102,3103 m g/ L,）；,M n,、,Zn,、,Co,、,M o,、,C u,、,B,、,I,等微量元素（,10 - 2,30 m g/ L,）。,(2),植物细胞需要多种维生素和植物生长激素,:,如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。,培养液中维生素的浓度一般为,0. 1,100 m g/ L (,表,2-9);,而植物生长激素的浓度一般为,0. 1,10 m g/ L, (3),植物细胞要求的氮源一般为无机氮源,:,即可以同化硝酸盐和铵盐。,(4),植物细胞一般,以蔗糖为碳源,:,蔗糖的浓度一般为,2 %,5 %,。,2.,几种常用的植物细胞培养基,MS,培养基（,LS,和,RM,培养基,）,B5,培养基,White,培养基,KM-8 P,培养基,应用最广的是,MS,培养基和,LS,培养基,MS,培养基是,1962,年由,Murashinge,和,Skoog,为烟草细胞培养而设计的培养基。,LS,、,RM,培养基是在其基础上演变而来的。,3.,植物细胞培养基的配制,将各种组分分成大量元素液、微量元素液、维生素溶液和植物激素溶液等几个大类,先配制成,10,倍或者,100,倍浓度的母液,放在冰箱保存备用。在使用时,吸取一定体积的各类母液,按照比例混合、稀释,制备所需的培养基。,(,三,),温度的控制,植物细胞培养的温度一般控制在室温范围,(25,左右,),。温度高些,对植物细胞的生长有利,温度低些,则对次级代谢物的积累有利。但是通常不能低于,20,也不要高于,35,。,有些植物细胞的最适生长温度和最适产酶温度有所不同,要在不同的阶段控制不同的温度。,(,四,) pH,值的控制,植物细胞的,p H,值一般控制在微酸性范围,即。培养基配制时,pH,值一般控制在,5.5,5.8,范围,在植物细胞培养过程中,一般,p H,值变化不大。,(,五,),溶解氧的调节控制,植物细胞的生长和产酶需要吸收一定的溶解氧。,溶解氧一般通过通风和搅拌来供给。,适当的通风、搅拌还可以使植物细胞不至于凝集成较大的细胞团,以使细胞分散,分布均匀,有利于细胞的生长和新陈代谢。然而,由于植物细胞代谢较慢,需氧量不多,过量的氧反而会带来不良影响。加上植物细胞体积大、较脆弱、对剪切力敏感,所以通风和搅拌不能太强烈,以免破坏细胞。这在植物细胞反应器的设计和实际操作中,都要予以充分注意。,(,六,),光照的控制,大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定波长的光的照射,并对光照强度和光照时间有一定的要求,而有些植物次级代谢物的生物合成却受到光的抑制。,在植物细胞培养过程中,应当根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同,进行光照的调节控制,(,七,),前体的添加,前体,是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。,为了提高植物细胞培养生产次级代谢物的产量,在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。,(,八,),刺激剂的应用,刺激剂,(elecitor),可以促使植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行,从而强化次级代谢物的生物合成,提高某些次级代谢物的产率。所以在植物细胞培养过程中添加适当的刺激剂可以显著提高某些次级代谢物的产量。,常用的刺激剂：,微生物细胞壁碎片,和,果胶酶,、,纤维素酶,等微生物胞外酶。,四、植物细胞培养产酶的工艺过程,以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（,SOD,）为例,(1),大蒜愈伤组织的诱导,选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用,70%,乙醇消毒,20s,，再用,0.1%,升汞消毒,10min,，然后无菌水漂洗,3,次。,在无菌条件下，切成,3,的小块，植入含有,3mg/L 2,4-D,和的半固体,MS,培养基中，在,25,，,600lux,，,12h/d,光照条件下培养,18d,，诱导得到愈伤组织，每,18,天继代一次。,(2),大蒜悬浮细胞培养,将上述在半固体,MS,培养基上培养,18d,的愈伤组织，在无菌条件下转入含有,3mg/L 2,4-D,和 （苄基腺嘌呤） 的液体,MS,培养基中，加入灭菌的玻璃珠，,25,，,600lux,，,12h/d,光照条件下震荡培养,18d,，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。,然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有,3mg/L 2,4-D,和的液体,MS,培养基中，,25,600lux,，,12h/d,光照条件下震荡培养,18d,。,(3),酶的分离纯化,细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。,超氧化物歧化酶,(S O D),：,是催化超氧负离子进行氧化还原反应的氧化还原酶,具有抗辐射、抗氧化、抗衰老的功效。,S O D,可以从动物、植物和微生物细胞中提取分离得到。,第二节 动物细胞培养产酶,动物细胞培养是在,20,世纪,50,年代,伊尔勒,( Earle),等人开始进行病毒疫苗细胞培养的基础上,于,20,世纪,60,年代迅速发展起来的技术。,1967,年 开发的适合动物细胞贴壁培养的微载体技术, 1975,年 发明的杂交瘤技术,有力地推动了动物细胞培养技术的发展。,已经在疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质的生产中广泛应用,工业化生产达到,20 000 L,甚至更大的规模,已经成为生物工程研究开发的重要领域。,1.,动物细胞的特性,(1),在于没有细胞壁,(2),动物细胞的体积比微生物细胞大几千倍,稍小于植物细胞的体积。,(3),大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在,在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性。,(4),动物细胞的营养要求较复杂,必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进,5 %,10 %,的血清。,2.,动物细胞培养的特点,主要用于各种功能蛋白质的生产。,细胞生长速度慢。（需添加抗生素）,细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。,反应过程成本高，产品价格贵。,大多数细胞具有锚地依赖性，宜贴壁培养；部分细胞可采用悬浮培养。,动物细胞培养基成分较复杂,一般要添加血清或其代用品,产物的分离纯化过程较繁杂,成本较高。,原代细胞一般繁殖,50,代。,3.,培养方法,(1),悬浮培养,来自血液、淋巴组织的细胞,肿瘤细胞和杂交瘤细胞,(2),贴壁培养,存在于淋巴组织以外的组织、器官中的细胞（成纤维细胞、上皮细胞等）；采用,滚瓶培养系统,、,微载体系统,。,(3),固定化细胞培养,（,锚地依赖性和非锚地依赖性,细胞；,吸附法和包埋法,）,4.,培养基的组成与配置,动物细胞培养基的组分较为复杂,包括,氨基酸,、,维生素,、,无机盐,、,葡萄糖,、,激素,、,生长因子,等。,首先配制各类母液,如,100,倍浓度氨基酸母液、,1000,倍浓度维生素母液、,100,倍浓度葡萄糖母液,(,溶解于平衡盐溶液,),等,;,在使用前,分别吸取一定体积的母液,混匀得到混合母液,膜过滤除菌后,冷冻备用,;,使用时,取一定体积的混合母液,用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。,5.,培养条件的影响与控制,（,1,）温度：一般控制在,36.5,，波动范围,.,（,2,）,pH,值：一般控制在的微碱性范围内（最优）。,调节,pH,值,通常采用,CO,2,和,NaHCO,3,溶液；维持,pH,值的稳定,通常在培养液中加入缓冲系统；常用酚红监控,p H,值,（,蓝红色为,pH7.6,红色为,pH7.4,橙色为,pH7.0,黄色为,）。,（,3,）渗透压,:,应与细胞内渗透压相同。,（,4,）溶解氧：根据情况随时调节,。,6.,动物细胞培养产酶的工艺过程,通过动物细胞培养获得的酶主要有胶原酶、纤溶酶原活化剂、尿激酶等。现以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为例,说明动物细胞培养产酶的工艺过程及其控制。,工艺过程：,1.,人黑色素瘤细胞培养基（,Eagle,培养基）,2.,人黑色素瘤细胞培养,(1),将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理,分散,用,p H 7. 4,的磷酸缓冲液洗涤,计数,稀释成细胞悬浮液。,(2),在消毒好的反应器中装进一定量的培养液,将上述细胞悬浮液接种至反应器中,接种浓度为,(1,3)103,个细胞,/ml,于,37,的,CO2,培养箱中,通入含,5 % CO,2,的无菌空气,培养至长成单层致密细胞。,(3),倾去培养液,用,pH7.4,的磷酸缓冲液洗涤细胞,2,3,次。,(4),换入一定量的无血清,Eagle,培养液,继续培养。,(5),每隔,3,4,天,取出培养液进行,tPA,的分离纯化。,(6),然后再向反应器中加入新鲜的无血清,Eagle,培养液,继续培养,以获得大量,tPA,。,3.,组织纤溶酶原活化剂的分离纯化,组织纤溶酶原活化剂,(tissue plas minogen activator, tPA ),是一种,丝氨酸蛋白酶,它可以催化纤溶酶原水解,生成纤溶酶。纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解,对血栓性疾病有显著疗效。,纤溶酶原激活剂根据其结构和特性的不同,可以分为,组织纤溶酶原激活剂,(tissue plas minogen activator, tP A ),和,尿激酶纤溶酶原激活剂,( urokinase plasminogenactivator, uP A),两种。现在国内外应用的都是组织纤溶酶原激活剂。,1983,年,彭尼卡,(,Pennica),采用,克隆技术,将人的,tPA,基因转入大肠杆菌细胞并得到表达。随后在多种微生物和动物细胞中表达成功,现已成为销售量最大的基因工程药物之一。,