荧光定量PCR实验原理及数据分析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,*,Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,荧光定量,PCR,实验原理及数据分析,Marketing Dep.,Icy Wu,内容概要,荧光定量PCR的原理,荧光定量PCR的标记方法,荧光定量PCR解析方法,荧光定量实验流程及本卷须知,生工荧光定量产品选择指南,2,荧光定量,PCR,原理,定义,实时定量,PCR,技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，通过,Ct,值和标准曲线的关系对,起始模板,进行定量分析,与常规,PCR,技术比较：,对,PCR,扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，,无法对起始模板准确定量,，无法对扩增反应实时检测,3,荧光定量,PCR,原理,常用名词概念,扩增曲线,荧光阈值,Ct,值,4,4,荧光定量,PCR,原理,扩增曲线,5,Cycle循环数,Rn荧光强度,Baseline,Lg,liner phase,平台期,荧光基团,荧光检测元件,5,荧光定量,PCR,原理,荧光阈值,6,Cycle循环数,Rn荧光强度,Baseline,Lg,liner phase,平台期,前15个循环信号作为荧光本底信号baseline,荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段,真正的信号:荧光信号超过阈值,Threshold,6,荧光定量,PCR,原理,Ct,值,7,Cycle循环数,Rn荧光强度,Ct,值的定义：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Ct value,7,荧光定量,PCR,原理,Ct,值的重现性,8,横轴：,PCR,反映循环数,纵轴：荧光信号量,Ct,值的特点：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；,Ct,值极具重现性,8,荧光定量,PCR,原理,Ct,值定量的数学原理,9,理想的,PCR,反应,X,n,X,0,2,n,*,X,n,：第,n,次循环后扩增产物数量,X,0,：起始模板数量,n,：扩增循环数,9,荧光定量,PCR,原理,Ct,值定量的数学原理,10,非理想的,PCR,反应,XnX0 1Enn,*,X,n,：第,n,次循环后扩增产物数量,X,0,：起始模板数量,n,：扩增循环数,En,：扩增效率,10,荧光定量,PCR,原理,Ct,值定量的数学原理,11,在扩增产物达到荧光阈值时,XCtX0 * 1EnCtM 1,整理方程式2：,方程式1两边同取对数得：,X,Ct,：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为,M,Log2MLog2X0 *1EnCt 2,Log2X0 = Log 2M - Ct Log21En,11,荧光定量,PCR,原理,Ct,值与起始模板量的关系,12,Cycle number,Ck 10,4,Ck 10,2,Sample,Lg of DNA concentration,模板,DNA,量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即,Ct,值越小。,Log,模板起始浓度与,Ct,值呈线性关系。,12,荧光定量,PCR,原理,荧光定量反应性的确认,13,线性关系、扩增效率确认,相关系数R2：大于,标准曲线斜率：-3 ,PCR扩增效率E：,检测灵敏度确认,35Cycles内可得到好的定量结果,如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增,No template control确认,35 Cycles内无引物二聚体产生,13,内容概要,荧光定量PCR的原理,荧光定量PCR的标记方法,荧光定量PCR解析方法,荧光定量实验流程及本卷须知,生工荧光定量产品选择指南,14,14,常用荧光定量标记方法,15,非特异性荧光标记,SYBR Green I,特异性荧光标记,TaqMan Probe,15,SYBR Green I,染料法,原理,16,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,16,SYBR Green I,染料法,作用机理,17,热变性,引物退火,延伸反应,17,SYBR Green I,染料法,问题点与关键点,18,问题点：,SYBR Green I,与双链,DNA,进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。,关键点：,设计合适引物，防止非特异性扩增！,18,SYBR Green I,染料法,融解曲线,19,将温度与荧光强度的变化求导,(-dI/dT),原始图谱,对数图谱,19,SYBR Green I,染料法,融解曲线,20,融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：,定量准确,融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：,定量不准确,20,SYBR Green I,染料法,优缺点,21,使用方便，不必设计复杂探针,具有价格优势,优 点,无模板特异性,对引物特异性要求较高,不能进行多重定量,灵敏度相对较低,缺 点,21,Taqman,探针法,原理,22,5,端标记有报告基团,(Reporter, R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher, Q),探针完整，,R,发射的荧光能量被,Q,基团吸收 ，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,22,Taqman,探针法,工作机理,23,热变性,引物和探针与模板退火,延伸反应,探针,报告基团,淬灭基团,探针,DNA,聚合酶,引物,R,R,R,R,23,Taqman,探针法,PCR,体系的建立,引物、探针的设计：,探针Tm为68-70, 30 bp, 5不能有G, G可能会淬灭荧光素,引物尽量靠近探针, 扩增片段400 bp, 引物Tm为59-60,反应参数的确定：,一般为：94 ，10-20S,60，30-60S,Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高，也可通过温度梯度优化退火温度,优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值,引物浓度：100-900nM,探针浓度：50-300nM,其他与常规PCR相同,24,24,Taqman,探针法,优缺点,25,高度特异性,重复性好,灵敏度高,可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺 点,25,实时荧光定量,PCR,分类,分子信标,26,标记荧光的发夹探针,环与目标序列互补,茎由互补配对序列组成,环,茎,荧光素 淬灭剂,26,实时荧光定量,PCR,分类,分子信标,27,FRET,27,实时荧光定量,PCR,分类,分子信标,28,高特异性：对目标序列,检测,SNP,最灵敏的试剂之一,荧光背景低,优 点,只能用于一个特定目标,设计困难,价格比较高,缺 点,28,几种荧光定量,PCR,方法的应用比较,29,方法,优点,缺点,适用范围,SYBR Green I,适用性广,灵敏,方便,便宜,引物要求高,易出现非特异性带,适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究,TaqMan,特异性高,重复性好,价格高,只适合特定目标,病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病的诊断,分子信标,高特异性,荧光,背景低,只适合特定目标,设计困难,价格高,特定基因分析,SNP,分析,29,荧光定量,PCR,技术的主要应用,定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，SNPs分析等,绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等,相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等,30,30,内容概要,荧光定量PCR的原理,荧光定量PCR的标记方法,荧光定量PCR解析方法,荧光定量实验流程及本卷须知,生工荧光定量产品选择指南,31,31,荧光定量PCR的解析方法,绝对定量解析方法,相对定量解析方法,32,32,绝对定量的定义,33,Sample,25,Log起始浓度与循环数呈线性关系，通过起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系,根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,33,绝对定量分析几要素,34,一个,目的基因,即需要确定其量值的核酸序列。,一组,标准样本,用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、,PCR,产物、基因组,DNA,等。,重复反应孔,建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。,标记方法的选择,SYBR Green I,法或,Taqman,探针法均可。,实验结果显示,扩增曲线；标准曲线；融解曲线,(,探针法不需要,),。,34,绝对定量质粒标准品的制备,35,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,目的基因,基因组,DNA,质粒提取，,OD,值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用,35,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,36,倍比梯度稀释方法：,1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii,1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii,1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv,1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v,拷贝数的计算：,待测样本浓度ng/ul=OD26040稀释倍数,样本分子量=碱基数324,待测样本拷贝数copies/ul=待测样本浓度/样本分子量61014,36,绝对定量实验例,乙肝病人血液中,HBV,的绝对定量,37,方法：,从血液中提取病毒,DNA,，以,TaqMan,探针法进行荧光定量检测,标准品：,质粒标准品浓度为,10,6,、,10,5,、,10,4,、,10,3,；,2,个重复；设阴性空白对照,实验步骤：,提取,HBV DNA,；,设计特异引物；,设计,TaqMan,探针并标记探针；,荧光定量扩增；,结果分析：获取血液样品中,HBV DNA,的精确,copy,数。,37,绝对定量实验例,乙肝病人血液中,HBV,的绝对定量,38,Sample,copies/ml,Ct1,Ct2,Mean Ct,STD,标准品,510,3,28.18,28.64,28.41,0.16,标准品,510,4,25.25,25.14,25.19,0.04,标准品,510,5,22.11,22.46,22.28,0.12,标准品,510,6,18.63,18.92,18.77,0.10,未知样品,?,20.56,20.45,20.5,0.05,空白对照,None,None,38,绝对定量实验例,乙肝病人血液中,HBV,的绝对定量,39,扩增效率E计算,E =10-1/斜率 -1,=10-1/-3.29 -1,-1,标准曲线制作：,利用,Mean Ct,作图可得到标准曲线,y = -3.29x + 40.33 R,2,相关系数R2：大于，越接近1，结果可信度越高。,扩增效率E：0.8-1.2, 越接近1，越理想。,39,绝对定量实验例,乙肝病人血液中,HBV,的绝对定量,40,未知样品拷贝数的计算,将,Ct,值带入线性方程：,Quantity,Unknown,=10,=1,071,519 copies,X=,20.5-40.33,-3.29,=6.03,40,荧光定量PCR的解析方法,绝对定量解析方法,相对定量解析方法,41,41,相对定量的必要性,42,Sample B,Sample A,目的基因扩增效率相同,RNA,提取效率相同,细胞起始数相同,实际目的基因表达量分析,42,相对定量分析方法,43,比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！,关注点：,基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！,43,相对定量分析几要素,44,一个参照样本,一个或一个以上的未知样本,一个目的基因,管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量,重复反应孔建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性,标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可,实验结果显示扩增曲线；标准曲线有些分析方法不需要；融解曲线探针法不需要,一组标准样本有些分析方法不需要,44,相对定量分析,管家基因筛选,45,管家基因,维持细胞基本代谢活动所必须的基因,，,如：,GAPDH、Actin、18S rRNA,等,筛选方法,根据文献提供,通过具体实验筛选,0,1,2,3,4,5,6,Sample1,Sample2,Sample3,Sample4,实验组,实验值,-Actin,GAPDH,-2-microglobulin,HPRT,P,P,P,O,45,相对定量分析,两种常用的分析方法,46,双标准曲线法,2,-Ct,法,46,相对定量分析,双标曲线法,47,通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。,公式：,相对值,=,校正值,=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,待测样品的校正值,对照样品的校正值,47,相对定量分析,双标曲线法,48,优点：分析简单，实验优化相对简单,缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线,应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,检测样品,管家基因,H,目的基因,X,定量结果,定量结果,校正值,相对量,对照样品,6391.5,343.4,0.0537,1.000,待测样品,1,8589.7,17.3,0.0020,0.037,待测样品,2,7432.9,1946.1,0.2618,4.874,实验数据,48,相对定量分析,2,Ct,法,49,假设目标序列与内参序列扩增效率相同：,或,最后用任一样本 q 的 XN 除以参照因子calibrator，cb的 XN 得到：,对于一个少于,150bp,的扩增片断而言，如果,Mg 2+,浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于,1,。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：,X,T,是目标分子达到设定的阈值时的分子数,R,T,是内参分子达到设定的阈值时的分子数,49,相对定量分析,2,Ct,法,50,公式：,F =,2,优点：,无需作标准曲线,缺点：,假定扩增效率为,100 %,；,假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；,实验条件优化较为复杂。,应用：,基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,待测组目的基因平均,Ct,值,待测组内参基因,平均,Ct,值,对照组目的基因,平均,Ct,值,对照组内参基因,平均,Ct,值,50,相对定量分析,2,Ct,法,51,实验数据：,2,- Ct,法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近,100%,Ct处理前18171 Ct处理后1617.4=,Ct=Ct处理后Ct处理前1,比率处理后/处理前2Ct2 ,所以Jun基因在处理后表达水平是处理前的倍,修正方法：,如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于,2,，那么,2,Ct,可以修正为：,E,Ct,，例如扩增效率为,，那么计算公式可修正为,Ct,Sample,Jun,(Mean Ct),GAPDH,(Mean Ct),E,处理前,18,17,1.95,处理后,16,17.4,1.95,51,内容概要,荧光定量PCR的原理,荧光定量PCR的标记方法,荧光定量PCR解析方法,荧光定量实验流程及本卷须知,生工荧光定量产品选择指南,52,52,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,53,样品制备,定量体系配备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器介绍,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,53,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,54,样品制备,环境要求,定量体系配备,数据分析,RT,上机,浓度确定,无,RNase,环境,使用无,RNase,耗材,专用,RNase-free,工具,纯度高、完整性好的,RNA,分光光度计检测,电泳检测,54,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,55,样品制备,试剂选择,定量体系配备,数据分析,RT,上机,反应体系优化,AMV,M-MLV,高效，全长的,cDNA,下游反应数确定反转录体积,引物的选择,55,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,56,样品制备,误差控制,定量体系配备,数据分析,RT,上机,浓度确定,引物设计,环境要求,使用,mix,降低系统误差,设置重复（,3,次）,设置空白和阴性对照,均一的反应液和模板混合物,制作标准曲线,设定浓度区间,GC,：,50,60,Tm,：,50,65,单个碱基重复,4,个,无二级结构,扩增长度：,100,200bp,核酸制备区,反应液制备区,56,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,57,样品制备,定量体系配备,数据分析,RT,上机,反应体系优化,反应条件优化,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,退火温度优化：梯度,PCR,延伸时间：产物长度决定,反应体积,5ul,，推荐,20,50ul,引物浓度优化，模板量优化,Mg2,调节，酶活调节,扩增效率：,90,110,重复性：,std,0.2,标准曲线：,R,0.99,或,R2,0.98,57,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,58,样品制备,定量体系配备,数据分析,RT,上机,自配,购买即用型,RCHO-Lightcycler series,ROTOGEN-RG series,BIO-RAD Opticon series,ABI-7series,Bioer,Linegene series,分装控制,内参控制,机器校正控制,可靠，准确的数据,技能要求,误差控制,仪器介绍,试剂选择,58,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,59,样品制备,定量体系配备,数据分析,RT,上机,仪器介绍,分析方法,平滑曲线，重复性好，灵敏度高,相对定量：,2,Ct,法,绝对定量：标准曲线法,59,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,60,ABI 7500,ABI StepOne,Roche Lightcycler 480,Corbett Rotor-gene3000,Corbett Rotor-gene6000,60,荧光定量(SYBR Green)实验流程及本卷须知,61,Bio-rad MiniOpticon,杭州博日,LINE-GENE FQD-66A,Bio-rad iQ5,Stratagene Mx3005P,TM,Cepheid SmartCycler,61,内容概要,荧光定量PCR的原理,荧光定量PCR的标记方法,荧光定量PCR解析方法,荧光定量实验流程及本卷须知,生工生物分子生物学产品,62,62,分子生物学实验主要流程一览,63,生工生物分子生物学试剂盒产品线,64,生工生物核酸提取与纯化产品,通用型抽提系列,快速抽提系列,柱式抽提系列,mRNA,分离,miRNA,相关,一管式系列,Dzup,系列,快速抽提系列,柱式抽提系列,96,孔柱式抽提系列,15,1000 bp,寡聚核苷酸纯化,100 bp,10 kb PCR,产物纯化,96,孔,PCR,产物纯化,DNA,胶回收,50 bp,500 bp PAGE,胶,DNA,回收,柱式质粒抽提,小量5 ml ,中量50 ml ,大量100 ml ,96孔,一步法抽提1.5 ml ,无内毒素质粒抽提,酵母质粒抽提5 ml ,质粒提取,胶回收及,产物纯化,DNA,提取,RNA,提取,65,生工生物基因克隆相关产品,双链,DNA,补平和连接试剂盒,平端,DNA,片段添,dA,试剂盒,平端,DNA,片段添,dT,试剂盒,pUCm-T,载体,pSG-TS,载体,pUCm-B,载体,快速连接试剂盒,PCR,产物克隆试剂盒,超级感受态细胞制备试剂盒,高效感受态细胞制备试剂盒,快速感受态细胞制备试剂盒（一步法）,非感受态细胞转化试剂盒,平板涂布专用玻璃珠,感受态制备专用培养基胶囊,感受态细胞,克隆载体,DNA末端修饰与连接,66,生工生物PCR,/ RT-PCR,相关产品,热启动荧光定量,PCR,试剂盒,(Taqman,探针法,),荧光定量,PCR,试剂盒,(SYBR,染料法,),第一链cDNA合成试剂盒,M-MuLV:,长链,cDNA,合成,AMV:,高,GC,含量,cDNA,合成,一步法RT-PCR扩增试剂盒,M-MuLV/AMV,常规型,PCR,：,Taq : 100,7 kp,Pfu : 100,4 kp,即用型,PCR & PCR Mix,特殊型,PCR,：,长片段,PCR,扩增,(12 kb),高,GC,含量模板,PCR,扩增,PCR,RT-PCR,Real-time RT-PCR,67,Q&A,68,我的联系方式：,邬凡,