02第二章微生物发酵产酶第三章动植物细胞培养产酶

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 2 The Production of Enzyme by Fermentation of Microorganism,微生物发酵产酶,1,酶的生产方法,提取分离法,(EXtraction),生物合成,(Biosynthesis),化学合成,(chemicalsynthesis),SOD - blood,Papain-Papaya,Chymotrypsin-Pancrea,organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus,Protease from Bacillus,Phosphatase from Bacillus,Glucoamylase from Aspergillus,Plant cell culture,Animal cell culture,Few examples,2,酶的生物合成,：,酶在生物体内合成的过程,。,酶的发酵生产,：,经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。,* 大多数酶的生产采用发酵生产,原因：微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点,3,优良的产酶微生物具备的条件：,（,1,）酶的产量高；,（,2,）产酶稳定性好；,（,3,）容易培养和管理；,（,4,）利于酶的分离纯化；,（,5,）安全可靠、无毒性等。,4,酶的发酵生产的方式：,固体培养发酵,液体深层发酵,固定化微生物细胞发酵,固定化微生物原生质体发酵,5,Contents of chapter 2,1,、酶生物合成过程,2,、常见产酶微生物,3,、酶的发酵工艺条件及控制,4,、酶生产过程的动力学,Go,Go,Go,Go,5,、固定化微生物细胞发酵产酶,Go,6,、固定化微生物原生质体发酵产酶,Go,6,第一节 酶生物合成过程,The biosynthesis process of Enzyme,1,、中心法则,- Central Dogma,2,、,RNA,的生物合成,- Transcription,3,、蛋白质的生物合成,- Translation,4,、酶生物合成的调节,- Regulation,Go,Go,Go,Go,5,、酶生物合成的模式,- Pattern,Go,7,一、中心法则,-,Central Dogma,8,复制,Replication,：,亲代,DNA,或,RNA,在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代,DNA,或,RNA,的过程。,转录,Transcription,：,以,DNA,为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给,RNA,，形成一条与,DNA,链互补的,RNA,的过程。,翻译,Translation,：,亦叫转译，以,mRNA,为模板，将,mRNA,的密码解读成蛋白质的,AA,顺序的过程。,逆转录,Reverse translation,：,以,RNA,为模板，在逆转录酶的作用下，生成,DNA,的过程。,9,二、,RNA,的生物合成,(,转录,)- Transcription,细胞内,RNA,的生物功能,(1),在某些,RNA,病毒中，其所含的双链,RNA,作为遗传信息的载体。,(2),在蛋白质的生物合成过程中，各种,RNA,起着重要的作用。其中，,tRNA,作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别,mRNA,分子上的密码子；,mRNA,作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；,rRNA,与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。,10,(3),某些,RNA,具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。,(4),各种小分子,RNA,在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。,11,二、,RNA,的生物合成,转录,以,DNA,为模板合成,RNA,的过程称为,转录,（,transcription,）。转录是生物界,RNA,合成的主要方式，是遗传信息从,DNA,向,RNA,传递过程，也是基因表达的开始 。,RNA,合成分为识别与起始、延长和终止三个阶段。,12,转录过程的特点,1,、,转录的不对称性,：在,RNA,的合成中，,DNA,的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。,反义链,antisense strand,（无意义链，负链）：,在,RNA,的转录中，用作模板的,DNA,链称为反义链。,有义链,coding strand,（编码链，正链）：,在,RNA,的转录中，不作为模板的,DNA,链称为有义链。,13,2,、,转录所需酶：,依赖,DNA,的,RNA,聚合酶,又称为转录酶，是以,DNA,为模板的一类,RNA,聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由,1,种,RNA,聚合酶催化所有,RNA,的生物合成。而在真核生物中,RNA,聚合酶有,3,种,，分别为,RNA,聚合酶,、,RNA,聚合酶,和,RNA,聚合酶,，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为,4,10,个，亚基种类有,4,6,种。,14,转录过程,起始位点的识别,recognition,转录起始,initiation,链的延伸,elongation,转录终止,termination,转录后加工,modification,15,The,E. coli,RNA polymerase holoenzyme consists of,siX subunits:,a,2,bb,s.,Possible catalytic subunits,Promoter,specificity,Enzyme assembly,promoter recognition,activator binding,Role unknown,(not needed,in vitro,),36.5 kDa,151,155,11 kDa,(32-90 kDa),16,17,三、蛋白质的合成,(,翻译,)-Translation,翻译,:,以,RNA,中,mRNA,为模板,按照其,核苷酸顺序所组成的密码指,导蛋白质的合成的过程,.,mRNA,蛋白质,翻译,各种信息,各种蛋白质,（核苷酸排列顺序）,（氨基酸排列顺序）,18,蛋白质合成的几个要素,-mRNA(,模板，,template,),mRNA,是带有,DNA,遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。,以,mRNA,为模板,合成一定结构的多肽链的过程,(,翻译,),，就是将,mRNA,分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。,19,蛋白质合成的几个要素,-,遗传密码，,nucleotide triplet codon,mRNA,分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为,密码子,或,三联密码,。,四种核苷酸编成三联体可形成,4,3,个即,64,个密码子。其中：,一个起始密码,:,AUG,三个终止密码,:,UAA UGA UAG,多数氨基酸拥有,2-4,个密码,20,21,蛋白质合成的几个要素,-,转运,RNA (,transporter,),tRNA,是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。,tRNA,有特异性，至少有,20,种以上。每种,tRNA,的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的,反密码,，能与,mRNA,上相应的密码互补结合。,22,酪,5,5,3,AUG,GUU UAC ACA,酪氨酰,-,tRNA,反密码,mRNA,密码,(codon),与反密码,(anticodon),的碱基配对,23,蛋白质合成的几个要素,-,核糖体，,ribosome,核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和,rRNA,组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。,24,The ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic cell,25,蛋白质合成的几个要素,-,其他因子和酶,其他辅助因子,工具酶,26,蛋白质的合成过程,氨基酸的活化,activation,肽链合成的起始,initiation,肽链合成的延伸,elongation,肽链合成的终止与释放,termination and release,合成多肽的输送和加工,transport and modification,蛋白质分子的折叠,folding,27,蛋白质生物合成可分为四个阶段，氨基酸的活化、多肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止和释放。,氨基酸活化生成氨酰,tRNA,在氨酰,-tRNA,合成酶的作用下，氨基酸与,tRNA,结合为氨酰,-tRNA,。,28,（,1,）,AA+tRNA+ATP AA-tRNA+AMP+PPi,（,2,）,Met+tRNA+ATP Met-tRNA+AMP+PPi,（,3,）,N,10-,甲酰四氢叶酸,+,甲硫氨酸,-,tRNA,四氢叶酸,+,甲酰甲硫氨酸,-,tRNA,29,原核生物肽链合成的起始阶段是在,GTP,和起始因子（,Initiation Factor,）的参与下，核糖体,30 S,亚基，,fMet- tRNA,F,，,mRNA,和,50 S,亚基结合，组成起始复合物的过程。主要包括,5,个步骤：,（,1,）,30 S,亚基与起始因子,IF3,结合；,（,2,）,30 S,亚基与,mRNA,结合，形成,30 S-IF3-mRNA,复合物；,（,3,）,fMet- tRNA,F,与起始因子,IF2,以及,GTP,结合，生成,fMet- tRNA,F,-IF2-GTP,；,（,4,）在起始因子,IF1,的参与下，,fMet- tRNA,F,-IF2-GTP,与,30 S-IF3-mRNA,结合生成,30 S,起始复合物。在此,30 S,起始复合物中，,fMet- tRNA,F,上的反密码子正好与,mRNA,上的起始密码子,AUG,结合；,（,5,）,50 S,亚基与上述,30 S,起始复合物结合，形成完整的,70 S,核糖体。同时放出,IF1,，,IF2,，,IF3,，并使,GTP,水解生成,GDP,和,Pi,。在此,70 S,核糖体形成时，,fMet- tRNA,F,位于,70 S,核糖体的“,P”,位（肽酰基位），而它的“,A”,位（氨酰基位）是空位。,蛋白质合成起始,30,进位,转位,成肽,31,合成终止,32,高效率的蛋白质合成体系,33,蛋白质的空间结构如何形成？,功能与结构如何统一？,体外、体内的结构如何变化？,蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要,越来越多的基因工程产物需要复性复活,要求蛋白质折叠的理论及技术的指导,。,基因工程重组蛋白类产物必须要形成正确的折叠才能表现出功能和活性。,蛋白质的折叠,34,四、酶生物合成的调节,定义：,通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。,意义：,通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。,35,操纵子,基因表达的协同单位,操纵子,结构基因,（编码蛋白质, structural gene, S,）,控制部位,操纵基因（,operator gene, O,）,启动子（,promotor gene, P,）,（一）基因调控理论,Jacob and Monod,的,操纵子学说,（,operon theory,）,36,基因操纵子调节系统示意图,调节基因,启动基因 操纵基因 结构基因,DNA,转录,（,-,）,RNA,聚合酶,（,+,）,转录,翻译,mRNA,翻译,阻遏蛋白,蛋白质,诱导剂,控制区 信息区,操纵子,37,调节基因,(regulator gene),：,可产生一种组成型,调节蛋白,(regulatory protein),（一种变构蛋白），,通过与效应物,(effector),（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。,调节基因常位于调控区的上游。,38,cAMP-CRP,复合物的作用示意图,启动基因（,promotor gene,）（启动子）：,有两个位点：,（,1,）,RNA,聚合酶的结合位点,（,2,）,cAMP-CAP,的结合位点。,CAP,：分解代谢产物基因活化蛋白（,catabolite gene activator protein,），又称环腺苷酸受体蛋白,(cAMP receptor protein,，,CRP,）。,只有,cAMP-CRP,复合物结合到启动子的位点上，,RNA,聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。,39,操纵基因（,Operater gene,）,:,位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。,结构基因（,Structural gene,）,:,决定某一多肽的,DNA,模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为,mRNA,，再翻译为蛋白质。,40,(,二,),酶合成调节的类型,1.,诱导,(induction),诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似,物而临时合成的一类酶。,2.,阻遏,(repression),分解代谢物阻遏,(catabolite repression),反馈阻遏,(feedback repression),41,（三）酶合成的调节机制,1.,酶合成的诱导,加入某种物质，使酶生物合成开始或加速进行的现象。,酶合成诱导的现象：,已知分解利用乳糖的酶有：,-,半乳糖苷酶；,-,半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶,。,实验：,（,1,）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；,（,2,）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；,（,3,）表明菌体生物合成的经济原则：,需要时才合成,。,42,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,P,LacZ,LacY,Laca,mRNA,阻遏蛋白（有活性）,基 因 关 闭,启动子,O,R,P,LacZ,LacY,Laca,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,启动子,O,R,mRNAZ,mRNAY,mRNAa,阻遏蛋白（无活性）,基 因 表达,mRNA,A,、乳糖操纵子的结构,B,、乳糖酶的诱导,乳糖,阻遏蛋白（有活性）,诱导,43,2.,酶生物合成的反馈阻遏作用,由酶催化反应的产物或某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏,。,酶合成阻遏的现象：,实验：,（,1,）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （,2,）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （,3,）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则,:,不需要就不合成,。,44,色氨酸操纵子,酶的阻遏,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,阻遏蛋白不能与操纵基因结合，,结构基因表达,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,末端代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化,与操纵基因结合，结构基,因不能表达,45,酶的诱导和阻遏操纵子模型,B.,有活性阻遏蛋白加诱导剂,A.,有活性阻遏蛋白,C.,无活性阻遏蛋白,D.,无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂,操纵基因,启动基因,调节基因,结构基因,阻遏蛋白,(,有活性,),阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达,诱导物,诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达,酶蛋白,mRNA,阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达,阻遏蛋白,(,无活性,),酶蛋白,mRNA,代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达,代谢产物,46,调控方式,阻遏蛋白,添加物,与操纵基因结合,阻遏效应,举例,酶的诱导,有活性,不转录，,继而不翻译,诱导物,转录，,继而翻译,乳糖操纵子,酶的阻遏,无活性,阻遏物,不转录，,继而不翻译,色氨酸操纵子,酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比,47,3.,分解代谢物阻遏作用,指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。,分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。,48,分解代谢物阻遏现象：,实验：,细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的,“,二次生长现象,”,(diauXie,或,biphasic growth,）。,这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。,此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（,CRP,）,亦称降解物基因活化蛋白（,CAP,）。,49,分解代谢物阻遏,R,LacZ,LacY,Laca,mRNA,mRNAZ,mRNAY,mRNAa,基 因 表达,CAP,基因,结构基因,T,CAP,O,CAP,结合部位,RNA,聚合酶,T,cAMP,-CAP,P,葡萄糖,分解代谢产物,腺苷酸环化酶,磷酸二酯酶,ATP,cAMP,5-AMP,抑制,激活,葡萄糖降解物与,cAMP,的关系,cAMP,CAP,：降解物基因活化蛋白（,catabolic gene activation protein,）,降低,cAMP,浓度,使,CAP,呈失活状态,50,五、酶生物合成的模式,细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历,调整期、生长期、平衡期和衰退期,等,4,个阶段,51,酶生物合成的模式,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为,4,种类型。即,同步合成型,，,延续合成型,，,中期合成型,和,滞后合成型,。,52,五、酶生物合成的模式,（,1,）同步合成型：,酶的合成与细胞的生长同步进行。（,Fig,）,（,2,）延续合成型：,酶的合成伴随着细胞的生长而开始， 生长进入平,衡期后，酶又延续合成一段时间。,（,Fig,）,（,3,）中期合成型,酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平衡,期后，酶的合成随之停止。,（,Fig,）,(4),滞后合成型,当细胞进入平衡期后，才开始并大量积累酶,（,Fig,）,53,（,1,）酶的生物合成可以诱导，不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏；,（,2,）当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止；,（,3,）酶所对应的,mRNA,很不稳定。,Back,1,、同步合成型的特点,54,（,1,）酶的合成可以诱导，一般不受分解代谢物或产物的阻遏；,（,2,）酶所对应的,mRNA,相当稳定，在生长平衡期后仍可继续较长时间用于酶的合成。,2,、延续合成型的特点,Back,55,3,、中期合成型的特点,（,1,）酶的合成受到反馈阻遏；,（,2,）所对应的,mRNA,不稳定。,Back,56,（,1,）在对数生长期不合成酶（可能是受到分解代谢物阻遏的影响）；,（,2,）所对应的,mRNA,稳定性高。,4,、滞后合成型的特点,Back,57,（,1,）,mRNA,的稳定性；,（,2,）培养基中阻遏物存在与否。,影响酶生物合成的模式的主要因素是：,（,1,）,mRNA,稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其所对应的酶；,（,2,）,mRNA,稳定性差的，酶的合成随着细胞停止生长而终止；,（,3,）不受某些物质阻遏的，酶的合成随着细胞生长而同步增长。,（,4,）受某些物质阻遏的，需在细胞生长一段时间或在平衡期后（解除阻遏），开始合成酶。,规律：,58,（,1,）选择最理想的酶合成模式,延续合成型；,（,2,）改造非理想模式,A,、同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提,高相应的,mRNA,的稳定性；,B,、滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢,物阻遏，使酶合成提早开始；,C,、中期合成型：努力提高,mRNA,稳定性，解,除代谢物阻遏物。,选择与改造,59,第二节 产酶微生物的特点,Characteristics of Microorganism in Enzyme Production,基本要求,：,不是致病菌,发酵周期短,产酶量高,不易变异退化,最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。,对医药和食品用酶,还应考虑安全性：,60,基本要求,：,凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全,!,由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。,非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。,61,1,、 大肠埃希氏杆菌,(,Escherichia coli,),形态：短杆或长杆状，,0.5,1.01.0,3.0 um,，革兰氏阴性，运动,(,周毛,),或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。,Escherich,属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。,大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。,62,1,、 大肠埃希氏杆菌,应用：,大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖,大肠杆菌也是最早用作,基因工程的宿主菌,工业上生产,谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶,和,制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等,63,2,、枯草芽孢杆菌,（,Bacillus subtilis,）,直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，,革兰氏阳性，无荚膜，芽孢,0.51.51.8m,，中生或近中生。,64,2,、枯草芽孢杆菌,（,Bacillus subtilis,）,枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、,5,-,核苷酸酶、某些氨基酸及核苷,65,4,、曲霉,(Aspergillus),分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。,分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。,66,4-1,黄曲霉,(,Aspergillus flavus,),67,4-2,黑曲霉,(,Aspergillus niger,),68,4,、曲霉,(Aspergillus),应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。,69,5,、根霉,(Rhizopus),分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。,根霉因有假根（,Rhizoid,）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。,分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。,70,5-1,黑根霉,（,Rhizopus nigricans,）,也称面包霉，多腐生于含淀粉食品上。,菌丝体由分枝、不具横隔壁的菌丝组成，含有许多细胞核。,菌丝横生，向下有假根，向上可生出孢子囊梗，先端分隔形成孢子囊，生有许多黑色孢子，孢子可萌发成新菌株，也进行有性生殖。,常使蔬菜、水果、食物等腐烂。,71,5,、根霉,(Rhizopus),应用：,根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。,在酿酒工业上常用做糖化酶。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。,72,6,、酵母,(Sacchromyces),73,6-1,啤酒酵母（,Saccharomyces cerevisiae,）,啤酒工业上广泛应用的酵母。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。,74,第三节 发酵工艺条件及其控制,The Fermentation Principles and its Control,1,、培养基的配制,2,、发酵条件及控制,3,、提高产酶的措施,Go,Go,Go,75,细胞活化与扩大培养,保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的固体培养基上，在一定的条件下，进行培养，使细胞的生命活性得以恢复，这个过程称为,细胞活化,。,活化后的细胞需在种子培养基中经过一级乃至数级的,扩大培养,，以获得足够数量的优质细胞。,76,一、培养基的配制,各种生物对营养的需求,77,1,、选择适宜的营养物质,2,、营养物的浓度及配比合适,3,、物理、化学条件适宜,4,、经济节约,5,、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；,培养目的不同，原料的选择和配比不同；,不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,78,五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,培养基（,medium,）,是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质,。,任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素,79,构成细胞物质或代谢产物中碳架,碳源可作能源，为生命活动提供能量,常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物,异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）,水是微生物最基本的组成成分（,）,水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）,水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动,调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）,水,碳源,选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制,80,构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性,维持细胞结构的稳定性,调节细胞渗透压,控制细胞的氧化还原电位,有时可作某些微生物生长的能源物质,常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。,氮源,无机盐,需要注意合适的碳氮比,81,生长因子,生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。,分类：,化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类,功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应,实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,82,实验室的常用培养基：,细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；,放线菌：高氏,1,号合成培养基培养；,酵母菌：麦芽汁培养基；,霉菌： 查氏合成培养基；,例如枯草芽孢杆菌：,一般培养：肉汤培养基或,LB,培养基；,自然转化：基础培养基；,观察芽孢：生孢子培养基；,产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基,83,枯草杆菌,BF7658-,淀粉酶发酵培养基,：玉米粉,8%,，豆饼粉,4%,，磷酸氢二钠,0.8%,，硫酸铵,0.4%,，氯化钙,0.2%,，氯化按,0.15%,（自然,pH,）。,枯草杆菌,AS1.398,中性蛋白酶发酵培养基,：玉米粉,4%,，豆饼粉,3%,，麸皮,3.2%,糠,1%,磷酸氢二钠,0.4%,磷酸二氢钾,0.03%,（自然,pH,）。,黑曲霉糖化酶发酵培养基,：玉米粉,10%,，豆饼粉,4%,，麸皮,1%,（,pH4.4,5.0,）。,地衣芽孢杆菌,2709,碱性蛋白酶发酵培养基,：玉米粉,5.5%,豆饼,4%,磷酸氢二钠,0.4%,磷酸二氢钾,0.03%(pH 8.5),。,黑曲霉,AS 3.350,酸性蛋白酶发酵培养基,:,玉米粉,6%,豆饼粉,4%,玉米浆,0.6%,氯化钙,0.5%,氯化铵,1%,磷酸氢二钠,0.2% (pH 5.5),。,84,游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基,：糖蜜,2%,，豆饼粉,2%,，磷酸氢二钠,0,。,1%,，硫酸镁,0,。,05% (pH 7.2),。,桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基,：淀粉水解糖,5%,，蛋白胨,0.5%,硫酸镁,0.05%,氯化钙,0.04%,磷酸氢二钠,0.05%,磷酸二氢钾,0.05% (,自然,pH),。,黑曲霉,AS3.396,果胶酶发酵培养基,:,麸皮,5%,果胶,0.3%,硫酸铵,2%,磷酸二氢钾,0.25%,硫酸镁,0.05%,硝酸钠,0.02%,硫酸亚铁,0.001% (,自然,pH),。,枯草杆菌,AS1.398,碱性磷酸酶发酵培养基,:,葡萄糖,0.4%,乳蛋白水解物,0.1%,硫酸铵,1%,氯化钾,0.1%,氯化钙,0.1mmol/L,氯化镁,1.0mmol/L,磷酸氢二钠,20mol/L (,用,pH7.4,的,Tris-HCl,缓冲液配制,),85,二、发酵条件及控制,细胞发酵产酶的最适,pH,值与生长最适,pH,值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适,pH,值通常接近于该酶催化反应的最适,pH,值。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的,pH,值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,1,、,pH,的调节控制,86,2,、,温度的调节控制,枯草杆菌的最适生长温度为,34,37,黑曲霉的最适生长温度为,28,32 ,87,通常在生物学范围内每升高,10,，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的,mRNA,的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。,2,、,温度的调节控制,88,3,、,溶解氧的调节控制,在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。,89,调节通气量,调节氧的分压,调节气液接触时间,调节气液接触面积,改变培养液的性质,控制溶解氧方法,3,、,溶解氧的调节控制,90,三、提高酶产量的措施,添加诱导物,控制阻遏物的浓度,添加表面活性剂,添加产酶促进剂,91,1,、添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。,例如，乳糖诱导,-,半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。,诱导物一般可以分为,3,类：,酶的作用底物,酶的催化反应产物,作用底物的类似物,92,2,、控制阻遏物的浓度,为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当,控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度,。,采用其他较难利用的碳源，如淀粉等,采用补料、分次流加碳源,添加一定量的环腺苷酸（,cAMP,）,对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过,控制末端产物浓度的方法使阻遏解除,。,93,3,、添加表面活性剂,表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。,将适量的,非离子型表面活性剂,，如,吐温（,Tween,）,、,特里顿,(Triton),等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。,由于,离子型表面活性剂对细胞有毒害作用,，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。,94,4,、添加产酶促进剂,产酶促进剂是指,可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质,。,例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高,1,20,倍；添加聚乙烯醇（,Polyvinyl alcohol,）可以提高糖化酶的产量。,产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，,要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度,。,95,第四节 酶发酵动力学,研究发酵过程中细胞生长速度,产物生成速度及环境因素对这些速度的影响,.,96,一、细胞生长动力学,二、产酶动力学,三、基质消耗动力学,本节主要内容,:,酶发酵动力学研究意义,:,理解酶生物合成模式基础上,发酵工艺条件优化控制,提高酶产量,.,97,一、细胞生长动力学,主要研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律。,1950,年,法国的,Monod,首先提出表述微生物生长的动力,学方程,细胞生长速率与细胞浓度成正比,。,R,X,=dX/dt= X,:,比生长速率,只存在一种限制性基质时,:,Monod,方程是基本的细胞生长动力学方程,;,从不同情况出发对其进行修饰,.,98,dX/dt=(-D)X D,：稀释率,连续全混流反应器发酵过程中,稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程,:,D=0,，分批发酵,;,D,，,细胞浓度下降，,S,升高，,回升,;,D,m,，,X,趋于,0;,99,Monod,方程与米氏方程相似,参数,u,m,与,Ks,也可由双倒数作图法求出,.,双倒数作图法,100,二、产酶动力学,宏观产酶动力学,（非结构动力学）,:,从整个发酵系统着眼,研究群体细胞的产酶速率 ；,微观产酶动力学,（结构动力学）,:,从细胞内部着眼,研究细胞中酶合成速率。,1,、分类,研究细胞产酶速率及各因素对其的影响,.,101,X,细胞浓度；,细胞比生长速率；,生长偶联的比产酶系数；,非生长偶联的比产酶速率。,2,、宏观产酶动力学方程通式,dE/dt=(+)X,（,1,）,同步合成型：,生长偶联型,=0,，,dE/dt=,X,（,2,）,中期合成型：,特殊生长偶联型,有阻遏存在时，,=0,，无酶产生，,dE/dt= 0,阻遏解除后才开始合成酶,=0,，,dE/dt=,X,.,细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同。,讨论,:,102,（,3,）,滞后合成型：,非生长偶联型，,=0 , dE/dt=X,（,4,）,延续合成型：,部分生长偶联型，,0,，,0,dE/dt= ,X+X,有关模型参数一般通过线性化处理及尝试误差法求出,.,103,三、基质消耗动力学,在发酵过程中，培养基中的限制性基质不断被消耗，被消耗的基质主要用于细胞生长、产物生成合维持细胞的正常新陈代谢三个方面。,细胞生长的基质消耗速率,dS 1 dX,X,- = = ,dt,G,Y,x/s,dt Y,x/s,104,产物生成的基质消耗速率,dS 1 dP,- = ,dt,P,Y,P/s,dt,维持细胞新陈代谢的基质消耗速率,dS,- = mX,dt,M,105,根据物料衡算，在发酵过程中，总的基质消耗动力学方程为：,dS,X,1 dP,R,s,= - = + + mX,dt Y,x/s,Y,P/s,dt,106,一、固定化细胞发酵产酶的特点；,二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制；,三、固定化细胞生长和产酶动力学。,本节主要内容：,第五节 固定化细胞发酵产酶,107,第五节 固定化微生物细胞发酵产酶,又称固定化活细胞、固定化增殖细胞，是指用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。是,70,年代后期,(1978),发展起来的技术,;,在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面取得了成功。,固定化细胞：,108,一、固定化细胞发酵产酶的特点,1,、提高产酶率：,细胞密度增大,生化反应加速,产酶率提高,109,1,、提高产酶率；,2,、可以反复使用或连续使用较长时间,;,3,、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；,4,、发酵稳定性好：细胞受载体保护，,pH,和,T,适应性宽；,5,、缩短发酵周期，提高设备利用率；,6,、产品容易分离纯化；,7,、适于胞外酶等胞外产物的生产。,一、固定化细胞发酵产酶的特点,110,二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制,与游离细胞发酵大同小异，需特别注意的几个问题：,1,、固定化细胞的预培养,先预培养，使固定在载体上的细胞生长繁殖，长好后，再用于发酵产酶，其培养基和工艺条件可以相同或不同。,111,二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制,2,、溶解氧的供给,由于受到载体的影响，使氧的供给成为主要的限制性因素。,解决办法：,（,1,）加大通气量（强烈搅拌会破坏固定化细胞）；,（,2,）改变固定化载体，如少用琼脂等对氧扩散不利的载体；,（,3,）过氧化氢酶与细胞共固定化，培养基加入适量的,H,2,O,2,；,（,4,）降低培养基的浓度，以降低培养基的粘度。,112,3,、温度的控制,连续发酵时，由于稀释率较高，反应器内温度变化较大，先预调,流加液,温度。,4,、培养基成份的控制,某些固定化载体的结构会受到某些成份的影响，如过量的磷酸盐会破坏海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞。,二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制,113,三、固定化细胞生长和产酶动力学,固定化细胞体系中细胞生长和产酶的动力学描述基本与游离细胞体系相同,;,在固定化细胞体系中细胞分两部分：,一部分是固定在载体上的细胞,浓度基本稳定,一部分是泄露到培养液中的细胞,如同游离细胞一样,114,由于泄露，体系中包括,固定和游离细胞。,dX/dt=(dX/dt),g,+(dX/dt),f,=,g,X,g,+ ,f,X,f,=,mg,SX,g,/(K,sg,+S),+,mf,SX,f,/(K,sf,+S),一般，,mg,mf,故固定在载体上的细胞生长,明显受抑制。,1,、固定化细胞生长动力学,115,一般认为：固定在凝胶中的细胞的产酶模式为非生长偶联型,;,游离细胞的产酶速率依细胞产酶模式不同而不同。,dE/dt = (dE/dt),f,+(dE/dt),g,=(+,)X,f,+X,g,=,f,X,f,+ ,g,X,g,f,：,游离细胞的比产酶速率,g,：,固定化细胞的比产酶速率,2,、固定化细胞产酶动力学,116,全混流下，,X,f,与流出反应器的游离细胞浓度相同,故有,:,细胞浓度,:,dX/dt=,g,X,g,+(u,f,-D)X,f,Du,f,游离细胞浓度越来越低,直达新的稳态,;,固定化细胞不受影响,故可在高稀释率下连续发酵,;,D=u,f,细胞浓度达动态平衡,;,产酶动力学方程,为,:,dE/dt =,f,X,f,+,g,X,g,例：,直径为,4mm,的固定化枯草杆菌，,D=0.43h-1,下连续发酵产,-,淀粉酶，测得,:,f,=0.572U/h,mg,，,g,=2.31U/h,mg,可见,g,是,f,的,4,倍多,.,3,、固定化细胞连续产酶动力学,117,第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶,本节主要内容：,一、固定化原生质体的特点,二、固定化原生质体发酵产酶工艺条件及其控制,118,第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶,原生质是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成的微球体。,由于原生质不稳定，通过凝胶包埋法可使之稳定性提高；,可使原来胞内产物分泌到细胞外。,119,一、固定化原生质体的特点,1,、变胞内产物为胞外产物；,2,、提高产酶率；,3,、稳定性较好；,4,、易于分离纯化。,120,二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制,（,1,）渗透压的控制；,（,2,）防止细胞壁的再生；,（,3,）保证原生质体的浓度。,121,第三章 动、植物细胞培养产酶,（自学）,与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。,122,动物细胞模式图,123,植物细胞结构,124,植物、动物、微生物细胞的特性比较,细胞种类,植物细胞,微生物细胞,动物细胞,细胞大小,/um,200,300,1,10,10,100,倍增时间,/h,12,0.3-6,15,营养要求,简单,简单,复杂,光照要求,大多数要求,不要求,不要求,对剪切力,敏感,大多数不敏感,非常敏感,主要产物,色素、药物、香精、酶等,醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等,疫苗、激素、单克隆抗体、酶等,125,三者之间的差异主要有：,植物细胞,动物细胞,微生物细胞。,动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。,植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。,植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。,植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。,植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。,126,一、植物细胞培养产酶,1.,植物细胞培养的特点,2.,培养基特点,应用最广的是,MS,培养基和,LS,培养基,MS,培养基是,1962,年由,Murashinge,和,Skoog,为烟草细胞培养而设计的培养基。,LS,培养基是在其基础上演变而来的。,127,3.,培养方法：,悬浮细胞培养,细胞株的建立；外植体与愈伤组织,扩大培养；,大罐培养；,128,外植体：,从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。,愈伤组织：,将上述外植体植入诱导培养基中，于,25,左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。,129,水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织,外植体,愈伤组织,130,4.,培养条件的影响与控制,（,1,）温度,（,2,）,pH,（,3,）通气与搅拌,（,4,）光照的控制,（,5,）前体的添加（饲喂）,（,6,）诱导子（,elicitors,）的应用,131,5.,植物细胞培养产酶实例,以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（,SOD,）为例,(1),大蒜愈伤组织的诱导,选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用,70%,乙醇消毒,20s,，再用,0.1%,升汞消毒,10min,，然后无菌水漂洗,3,次。,在无菌条件下，切成,0.5cm,3,的小块，植入含有,3mg/L 2,4-D,和,1.2mg/L 6-BA,的半固体,MS,培养基中，在,25,，,600lux,，,12h/d,光照条件下培养,18d,，诱导得到愈伤组织，每,18,天继代一次。,132,(2),大蒜悬浮细胞培养,将上述在半固体,MS,培养基上培养,18d,的愈伤组织，在无菌条件下转入含有,3mg/L 2,4-D,和,1.2mg/L 6-BA,（苄基腺嘌呤） 的液体,MS,培养基中，加入灭菌的玻璃珠，,25,，,600lux,，,12h/d,光照条件下震荡培养,18d,，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。,然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有,3mg/L 2,4-D,和,1.2mg/L 6-BA,的液体,MS,培养基中，,25,600lux,，,12h/d,光照条件下震荡培养,18d,。,133,(3),酶的分离纯化,细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。,134,二、动物细胞培养产酶,1.,动物细胞培养的特点,细胞生长速度慢。（需添加抗生素）,细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。,反应过程成本高，产品价格贵。,细胞具有锚地依赖性。,原代细胞一般繁殖,50,代。,135,2.,培养基,天然培养基,合成培养基,无血清培养基,136,3.,培养方法,(1),悬浮培养,(suspension culture),(2),贴壁培养,(anchorage-dependent culture),(3),贴壁悬浮培养,(pseudo-suspension culture),微载体培养,(microcarrier culture),包埋,(entrapment),和微囊,(microencapsulation),培养,结团培养,(aggregate culture),137,4.,培养条件的影响与控制,（,1,）温度：一般控制在,36.5.,（,2,）,pH,值：一般控制在的微碱性范围内。,（,3,）渗透压,:,应与细胞内渗透压相同。,（,4,）溶解氧：根据情况随时调节,。,138,