补体系统与疾病

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,补体系统与疾病,概 述,补体系统是由存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组可溶性蛋白及存在于血细胞与其它细胞表面的一组膜结合蛋白和补体受体所组成。,在机体的免疫系统中担负抗感染和免疫调节作用, 并参与免疫病理反应。,补体是天然免疫（,Innate immunity,）的重要组成部分。,Jules Bodet (1870-1961),Discoverer of Complement,1894 Bordet,发现绵羊抗霍乱血清能够溶解霍乱弧菌，加热,56 30 min,阻止其活性。,Ehrlich,在同时独立发现了类似现象，将其命名为,补体（,Complement,）,补体系统的组成：,补体,分子,补体受体,C1C9,B,、,D,、,P,因子,C1INH,、,C4BP,、,H,、,I,、,S,蛋白,C1qR,、,C3b/C4bR (CRI),、,3dR(CRII),、,H,因子受体、,C3a,和,C5a,受体等,一、,第一组分：,是由,9,种补体成分组成，命名为,C1,，,C2C9,。其中,C1,是由三个亚单位组成，命名为,Clq,、,Clr,、,Cls,，因此第一组分是由,11,种球蛋白组成。,二、,第二组分：,在,70,年代又发现一些新的血清因子也参与补体活化，但它们不是经过抗原抗体复合物的活化途径，而是通过旁路活化途径。这些因子包括,B,因子、,D,因子和,P,因子。,三、,第三组分：,多种参与控制补体活化的抑制因子或灭活因子，如,C1,抑制物、,I,因子、,H,因子、,C4,结合蛋白过敏毒素灭活因子等。这些因子可控制补体分子的活化，对维持补体在体内的平衡起调节作用。,补体分子的组分,一、由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生均为多糖蛋白，大多数电泳迁移率属,、,球蛋白。,二、含量约占血清球蛋白总量的,10%,，其中,C3,含量最高、,D,因子含量最低。,三、固有成份间的分子量差异较大，其中,C1q,最大、,D,因子最 小。,四、对热不稳定，,56,、,30min,即被灭活，,0,10,条件下活性只能保持,3,4d,。,五、多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加剂等均可破坏补体。,补体分子的理化性质,补体系统的激活,补体系统各成分通常多以非活性状态存在于血浆中，当其被激活物质活化之后，才表现出各种生物学活性。,经典途径,:,由抗原抗体复合物结合,C1q,启动。,旁路途径,:,由病原微生物等提供接触表面，而从,C3,开始激活。,MBL,途径,:,由,MBL,结合至细菌启动。,经典途径（,classical pathway,）,经典途径按其在激活过程中的作用，分为三组：,1.,识别单位： 包括,C1q,，,C1r,，,C1S.,2.,活化单位： 包括,C4,，,C2,，,C3.,3.,膜攻击单位： 包括,C5,9,。,Fab,段,Fc,段,暴露的,C1q,结合位点,IgG,分 子 结 合 抗 原 前 后 的 构 象 变 化,C1q,结合位点被屏障,结合抗原之前,结合抗原之后,C,H1,C,H2,IgM CH3,区，,IgG CH2,区,T,Y,C1q,C1qr2s2,C1r,C1s,40nm,抗 原,抗体,抗 原,补体活 化的经典 途径,C1,由 一个,C1q,、两个,C1r,和两个,C1s,分子的共同组成。一个,C1q,分子如果同时与两个以上的,Fc,段结合将造成其构象的变化，继之使,C1r,和,C1s,活化，启动补体活化的经典途径。,旁路途径,(alternative pathway),旁路激活的激活物质为细菌的细胞壁成分（脂多糖、肽聚糖、磷壁酸和凝聚的,IgA,和,IgG,等物质）。,（一）,生理情况下：,C3,与,B,因子、,D,因子等相互作用，可产生极少量的,C3b,和,C3bBb,（旁路途径的,C3,转化酶），但迅速受,H,因子和,I,因子的灭活。,（二）,旁路途径的激活,：当细菌的脂多糖、肽聚糖、病毒、肿瘤细胞等激活物质出现时，,H,因子、,I,因子不能灭活,C3b,、,C3bBb,时使旁路途径被激活。（三）,激活效应的扩大,：当,C3,被激活后，裂解为,C3b,，,C3b,又可在,B,因子和,D,因子的参与作用下合成新的,C3bBb,，进一步促使,C3,裂解，血浆中有丰富的,C3,、,B,因子、,Mg2+,，就可能在激活部位产生显著的扩大效应，此为,C3b,的正反馈途径。,两条激活途径的比较,两条激活途径的共同点：（,1,） 两条途径都是补体各成分的连锁反应；（,2,） 许多成分在相继活化后被裂解成一大一小的两个片段；（,3,） 不同的片段或其复合物可在靶细胞表面向前移动，在激活部位就地形成复合物。,两条激活途径的主要不同点：,比较项目 经典途径 旁路途径,激活物质 免疫复合物 脂多糖、酵母多糖等,参与成分,C1C9 C3,B,、,D,、,P,因子,C5C9,所需离子,Ca,2+, Mg,2+,Mg,2+,C3,转化酶,C4b2b C3bBb,C5,转化酶,C4b2b3b C3bBb3b(C3bnBb),作 用 参与特异性体液 参与非特异性免疫,免疫效应阶段 （感染早期）,经典途径,MBL,途径,旁路途径,免疫复合物,病原体甘露糖残基,C1,、,C4,、,C2,MASP,、,C4,、,C2,病原体表面,C3,、,B,、,D,C3,转化酶,C5,转化酶,攻膜复合体,补体激活过程的调节,补体系统的激活必需在适度调节的情况下进行，才能发挥正常的生理学作用。补体激活失控，则大量补体无益消耗，导致机体感染能力下降，而且会使机体发生剧烈炎症反应或造成自身组织细胞的损伤。,补体活化途径的调节,主要包括：,（一）补体自身衰变的调节,（二）可溶性补体调节因子的作用,（三）膜补体调节蛋白和补体受体的作用,（一）自行衰变的调节,某些补体成分的裂解产物极不稳定，易于自行衰变，成为补体激活过程中的一种自控机制。例如：,C4b2b,中的,C2b,自行衰变，使其不能持续激活,C3,，限制了后续补体成分的连锁反应。,（二）,可溶性补体调节因子的作用,（,1,）,C1,抑制物,（,C1 inhibitor,，,C1INH,）,:,可与,C1,不可逆地结合，使后者失去酯酶活性，不再裂解,C4,和,C2,，不再形成,C4b2b,（,C3,转化酶），从而阻断或削减后续补体的反应。,（,2,）,C4,结合蛋白,（,C4 binding protein,，,C4bp,）,:,能竞争性地抑制,C4b,与,C2b,结合，因此能抑制,C42,的形成。,（,3,）,I,因子,（又称,C3b,灭活因子，,C3b inactivator,，,C3bINA,）,:,能裂解,C3b,，使其成为无活性的,C3bi,，因而使,C4b2b,及,C3bBb,均失去与,C3b,结合成,C5,转化酶的机会。,（,4,）,H,因子,（,factor H,）,:,H,因子不仅能促进,I,因子灭活,C3b,的速度，更能竞争性地抑制,B,因子与,C3b,的结合，还能使,C3b,从,C3bBb,中置换出来，加速其灭活。,（,5,）,S,蛋白,（,S protein,）,:,S,蛋白能干扰,C5b67,与细胞膜的结合。,（,6,）,C8,结合蛋白,（,C8 binding protein,，,C8bp,）（又称同源性限制因子，,homologous restriction factor,，,HRF,）,: C8bp,可阻止,C5678,中的,C8,与,C9,的结合，从而避免危及自身细胞膜的损伤作用。,1. C1,抑制分子（,C1 inhibitor, C1INH),结合活化的,C1rC1s,，使其失去正常酶解底物,C4,和,C2,的功能,C1IHN,缺陷引起血管神经性水肿,2. C4,结合蛋白（,C4 Binding Protein),结合,C4b,，抑制,C4b,与,C2,的结合，防止,C3,转化酶的组装，促进,I,因子对,C4b,的蛋白水解。,3. H,因子,（,factor H),能与,C3b,结合，抑制旁路途径,C3,转化酶,（,C3bBb,）,作为,I,因子的辅助因子（,Cofactor,）,水解,C3b,为,iC3b,和,C3f,4. I,因子（,FactorI,）,裂解,C3b,为,iC3b,和,C3f,继而裂解,iC3b,为,C3c,和,C3dg,裂解,C4b,为,C4c,和,C4d,5.,蛋白的作用,结合,5b67,阻止膜攻击复合物的形成,补体调节的同源限制,1.,当靶细胞与补体均来自同一种属时，补体溶细胞效应受到抑制。,2.,导致同源限制的调节蛋白称为同源限制因子（,homologous restriction factors,，,HRF,）：,CD46(MCP),、,CD55(DAF),、,CD59,和,CR1,等。,DAF (Decay Accelerating Factor, CD55),促衰变因子,CD59: C8,结合蛋白，结合,C8,阻断,C9,的聚合,补体受体及其功能,一,. CR1,（,CD35,）,CR1,的免疫功能：,（,1,） 中性粒细胞，单核，巨噬细胞上的,CR1,，可与结合在细菌或病毒上的,C3b,结合，促进吞噬细胞的吞噬作用,;,（,2,）,CR1,与,C3b,或,C4b,结合后，可促使,C3,转化酶（,C3bBb,或,C4b2a,）降解,;,（,3,） 作为,I,因子的辅助因子，促进,I,因子对,C3b,和,C4b,的裂解作用,;,（,4,）,CR1,体内,90,的,CR1,存在于红细胞上,带有,C3b,的免疫复合物与红细胞的,CR1,结合后，可随血流到肝脏被清除,;,（,5,）,B,淋巴细胞膜上的,CR1,对,B,细胞的分化有促进作用。,CR1,的清除免疫复合物效应,2,. CR2(CD21),其配体为,C3dg,、,C3d,和,iC3b,CR2,主要存在于成熟,B,细胞和树突状细胞，单核细胞、,K,细胞、胸腺细胞也表达少量,CR2,。,CR2,的功能,:,调节,B,细胞活化,介导,EBV,感染,结合免疫复合物，促进吞噬作用,三,. CR3,（,CD11b/CD18,）,CR3,的配体是,iC3b,，但,CR1,、,CR2,也和,iC3b,反应。主要分布于中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞上；,CR3,和,CR4,（,CD11c/CD18,）参与调理吞噬作用；,白细胞粘附缺陷病（,leucocyte adhesion deficiency,）病人缺乏,链。病人的中性粒细胞虽正常，但不能留在感染的部位，因此病人易反复遭受感染。,中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞高度表达本受体，与吞噬功能有关。其配体为,iC3b,、,C3d,和,C3dg,。,三,. CR4,（,gp150/95,，,CD11c/CD18,）,名称,别名,CD,分类,配体特异性,细胞分布,CR1,IA,受体,C3b,受体,C4B/C3b,受体,CD35,C3bi,、,C3b,C4b,、,iC4b,C3c,红细胞、中性粒细胞,单核细胞、巨噬细胞,B,细胞、树突状细胞,肾小球上皮细胞,CR2,C3d,受体,EB,病毒受体,CD21,ic3b,、,C3dg,C3d,、,EB,病毒、,1FN-,B,细胞、树突状细胞,CR3,iC3b,受体,Mac-1,抗原,CD11b/CD18,iC3b,、植物凝集素、某些细胞多糖,中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、,NK,细胞,CR4,gp150/95,CD11C/CD18,ic3b,、,C3d,、,C3dg,中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板,补体受体的特征,补体的生物学功能,（一）溶菌和细胞溶解效应,补体系统通过经典途径、旁路途径或,MBL,途径被活化后，可在靶细胞上形成膜攻击复合物，导致靶细胞的溶解；,补体的这一功能在机体的免疫系统中起重要的防御和免疫监视作用，可以抵抗病原微生物的感染；,当某些病人出现先天性或后天性的补体缺陷时，出现的最重要表现是容易遭受病原微生物的侵袭而出现反复性感染。,溶菌,溶细胞,补体的溶细胞作用,（二）调理作用,调理作用又称促吞噬作用，补体和抗体均具有调理作用。在吞噬细胞表面有多种补体受体，如,CR1,，,CR2,，,CR3,等，结合了靶细胞或抗原的补体片段（,C3b/C4b),可与吞噬细胞表面的补体受体特异结合，促进两者的接触，增强吞噬作用和胞内氧化作用，最终使机体的抗感染能力增强,。,（三）免疫粘附和清除免疫复合物,细菌或免疫复合物激活补体、结合,C3b/C4b,后，若与表面具有相应补体受体（,CR1,）的,RBC,和血小板结合，则可形成较大的聚合物，通过血液循环到达肝脏和脾脏，被巨噬细胞吞噬。,补体调理作用,免疫复合物,C3b,受体,红细胞,补体的免疫黏附作用,清除免疫复合物,（四）促进中和及溶解病毒作用,在病毒与相应抗体形成的复合物中加入补体，可明显增强抗体对病毒的中和作用；,在没有抗体存在时，补体也可对病毒产生溶解灭活作用。,（五）炎症反应,C3a,，,C4a,，,C5a,，具有过敏毒素作用，,可使表面具有相应受体的肥大细胞和嗜碱性粒细胞等脱颗粒，释放组胺等血管活性物质，引起血管扩张、通透性增强、平滑肌收缩和支器官痉挛等的作用；,C3a,和,C5a,对中性粒细胞具有趋化作用,，吸引具有相应受体的中性粒细胞和单核吞噬细胞向补体激活的炎症区域游走和聚集，增强炎症反应；,C2a,具有激肽样作用,：使小血管扩张、通透性增强、引起炎症性充血和水肿作用。,肥大细胞,过敏介质,C5a,C3a,补体的过敏毒素作用,C567,C5a,C3a,补体的趋化作用,中性粒细胞,单核,-,巨噬细胞,血管,组织,（六） 免疫调节作用,补体活化过程中产生的活性片段可与免疫细胞相互作用，对免疫功能起调节作用。例如，,C3d,，,Ba,，,Bb,等片段对,B,细胞的功能可产生调节作用；,C5a,可促进多种细胞因子如,IL-1,，,IL-6,，,IL-8,，,TNF,的产生等。,补体系统与疾病,炎症性,疾病,4.,补体与肿瘤,1.,补体缺陷,除了,C2,缺陷和,C1INH,缺陷相对较常见外，其它补体成分的缺陷均非常罕见。补体先天性缺陷患者的两大临床表现是反复感染和自身免疫病，这也从反面证实了补体在抗感染免疫和免疫调节方面的重要意义。,补体缺陷的临床表现,临床表现,主要相关的缺陷补体成分,次要相关的缺陷补体成分,遗传性血管神经性水肿,C1INH,严重顽固性皮肤损害,C1q,反复发作性细菌感染,C3,，,I,因子,C1r,，,C1q,免疫复合物性血管炎（包括肾炎）,C1q,，,C1r,，,C4,，,C2,C3,，,C5,反复发作性革兰氏阳性球菌感染,C5,，,C6,，,C7,，,C8,系统性红斑狼疮,CR1,C1IHN,缺陷引起血管神经性水肿,),由于,C,1,INH,缺陷，,C,1,便被无限制地激活，造成,C,4,、,C,2,裂解，因此,C,1,INH,缺陷中层患者常伴有,C,2,、,C,4,水平降低。在疾病发作时可测不到,C,4,和,C,2,。,C,1,INH,缺陷使血浆血管舒缓纱释放增加，从而使缓激肽、激肽均增加，引起血管通透性增加，形成组织水肿。,2.,补体与炎症性疾病,补体在活化过程中产生的片段具有一些新的生物学活性，其中,C5a,，,C3a,，,C4a,具有过敏毒素效应，,C5a,具有趋化活性，这些片段在促进炎症反应中起重要作用，因而在一些炎症相关的疾病中，补体起重要的病理作用,;,包括自身免疫病、心血管疾病、感染过程中的炎症性组织损伤、超急性移植排斥等,;,通过抑制补体有可能受到治疗疾病的效果。,补体与类风湿关节炎,图,1,补体激活促进类风湿关节炎发展,沉积在关节中的自身抗体、免疫复合物（,IC,）、凋亡细胞、死亡细胞以及纤维调节素（,FM）等分子以不同途径激活补体系统，最终形成攻膜复合体（MAC）破坏正常细胞和组织；同时，补体激活过程中释放的炎性过敏毒素C3a和C5a趋化和活化嗜中性粒细胞和巨噬细胞，这些细胞释放蛋白酶和细胞因子趋化T、B淋巴细胞和其它炎性细胞，进一步促进了炎症反应过程。,补体与系统性红斑狼疮（一）,Figure 2. DAF deficiency in MRL/lpr mice caused severe,dermatitis. Almost all MRL/lpr-DAFK/K mice developed severe skin inflammation and open lesion by 5 month old (A). None of the MRL/lpr littermate controls developed such skin disease (B).,补体在,SLE,病理过程中的作用有相当的复杂性，具有双重作用。,一方面，,SLE,患者体内补体被强烈活化，病变部位有补体沉积，表明补体在,SLE,中有病理损伤作用，尤其是狼疮肾炎，沉积于肾小球的免疫复合物通过激活补体，导致炎症性损伤；,另一方面，补体活化的经典途径早期蛋白成份的缺陷与,SLE,的易感性显著相关，并且补体与免疫球蛋白结合形成空间阻隔，阻断免疫球蛋白,Fc,和,Fc,的相互作用，从而抑制免疫复合物（,IC,）的形成或使其失去稳定性，同时通过结合,ICs,上的补体,C3b,与红细胞上的,CR1,受体结合，,ICs,被带到肝脾清除掉，提示补体的存在可能对抵抗,SLE,的发生发展具有保护作用。,补体与系统性红斑狼疮（二）,补体与缺血性中风,1999,年,Huang,等在,Science,发表论文证明：缺血性中风造成的神经炎性损伤与补体激活和,P,选择素高表达导致的中性粒细胞迁移有密切关系。,研究表明：脑缺血后血肿及其周围,C3d,活性增强，,72,小时达到高峰，到,7,天仍处于较高水平，侧基底节,C9,含量增加,6,倍，持续,3,天，随后沉积于神经细胞膜上，进一步提示脑中风后有补体系统的激活，并导致一系列炎性继发性脑损伤。,在诱导,C1q,基因缺陷的脑缺血小鼠模型中，由于缺乏经典补体活化途径，可以明显减轻继发性炎性损伤程度。,补体与缺血性中风,C3,基因缺陷组和靶向补体抑制物,CR2-Crry,治疗组与野生型对照组脑梗塞体积的对比,：,C3,基因缺陷组和,CR2-Crry,治疗组脑梗塞体积明显小于对照组,(p0.001),。,B,、,C,、,D,为脑组织,TTC,染色结果。,补体与缺血性中风,缺血性中风,24,小时后脑组织病理学情况对比,：,A-F,为,Nissl,染色，,GL,为,HE,染色，和野生型对照组相比，,C3,缺陷小鼠和,CR2-Crry,治疗小鼠对神经细胞有较好的保护功能。,补体与创伤性脊髓损伤（,SCI),创伤性脊髓损伤造成神经和血管结构的断裂（原发性损伤）和进行性的继发病理机制变化（继发性损伤），两者共同决定了功能恢复的程度。,研究发现在大鼠,SCI,模型中补体分子,C1q,、,C4,和,C5b9,大量沉积在损伤部位的神经元和少突神经胶质细胞上，并且在损伤的恢复过程中脊髓损伤部位中补体抑制物,H,因子水平明显升高，提示补体激活不仅参与了,SCI,的继发炎症损伤，而且补体抑制物通过抑制补体激活也促进了损伤的修复。,在,SCI,脊髓损伤部位免疫荧光染色检测,C3,分子的沉积,A,：损伤后,1h; B,：损伤后,24h; C,：损伤后,72h; D:,假手术对照组。,结果显示：,SCI,脊髓损伤部位有大量,C3,分子沉积，证明,SCI,继发炎症损伤与补体激活有关。,补体与创伤性脊髓损伤（,SCI),脊髓损伤后,7d,和,21d,损伤部位病理切片：,H&E,染色,结果显示：和对照组比较，,C3,缺陷小鼠组和,CR2-Crry,治疗组,7d,和,21d,坏死程度明显减轻。,补体与创伤性脊髓损伤（,SCI),3.,补体与病毒感染,补体受体及补体膜表面调节蛋白与病毒感染的关联受到越来越多的重视，一些病毒可通过补体受体等感染宿主细胞；,EB,病毒通过,CR2,感染,B,细胞，麻疹病毒通过,MCP,感染机体细胞，柯萨其病毒、埃可病毒和肠道病毒可通过,DAF,感染细胞等；,在临床上，可考虑应用补体受体的阻断剂治疗某系某些病毒感染。,4.,补体与器官移植的超急性、急性和慢性排斥反应,超急性移植排斥的主要原因是补体系统的全身性激活，导致对机体自身的广泛性组织损伤。,补体复合物,作用,排斥反应,超急性,急性 慢性,C1q,促进血小板黏附,+ + +,促进抗体的产生,+ +,加强,ADCC,+,Bb,促进,B细胞增殖,+ +,C3b,促进巨噬细胞、,NK细胞黏附,+,C3dg,促进,B细胞增殖及抗体,+ +,C3a和C5a,血管痉挛,+,C5a,增加血管通透性,+ +,破坏血管内皮抗凝作用,+ + +,淋巴细胞表达,CR1、CR2、CR3及LAF-1,+ +,C5b-C9,促进细胞因子分泌,+ +,增加血小板聚集和激活,+ + +,破坏血管内皮抗凝作用,+ + +,促进内皮细胞释放,PDGF和BFGF,+,补体与排斥反应,目前在临床前研究的解决方案是：,（,1,）利用补体抑制剂如可溶性,CR1,进行药物治疗；,（,2,）应用转基因技术,:,目前已开展了,CR1,、,DAF,、,CD59,、,MCP,等膜表面补体调节蛋白转基因猪的实验研究，将其器官移植至灵长类动物后，由于补体调节蛋白对补体的抑制作用，可有效阻止超急性移植排斥的发生，使移植的器官存活时间明显延长。,4.,补体与肿瘤,机体对肿瘤的免疫包括细胞免疫和体液免疫，体液免疫中通过抗体依赖介导的细胞毒作用（,ADCC,）和补体依赖的细胞毒作用,(CDC),作为体液免疫中重要的抗肿瘤机制；,补体调节蛋白（,CRP,）在调节补体攻击肿瘤细胞和在肿瘤逃避免疫攻击中起了非常重要的作用；,在胃癌、肠癌、肺癌、肾癌、子宫内膜癌、神经纤维瘤和乳腺癌等肿瘤表面高表达一种或多种补体调节蛋白（,CD46(MCP), CD55(DAF), CD59,），从而抑制补体对肿瘤的细胞溶解作用，使肿瘤逃避免疫攻击。,补体与肿瘤,补体调节蛋白（,CRP,）在肿瘤细胞上的高表达，一方面使肿瘤细胞逃避补体的攻击，另一方面也严重降低了治疗性单克隆抗体抗肿瘤效果（抑制了,CDC,作用）。,利用抗,HER-2/neu,抗体（,Herceptin,）诱导乳腺癌细胞的补体裂解作用，发现肿瘤细胞上的补体调节蛋白（,CRP,）被中和抑制后，补体依赖的细胞毒作用,(CDC),从,10%,升高到,80%,。,被,FDA,批准用于晚期乳腺癌治疗的,Herceptin,（抗,HER-2/neu,抗体）目前已进入,II,期临床试验治疗非小细胞肺癌,(non-small cell lung carcinoma,NSCLC),然而，临床实验结果显示：,Herceptin,治疗,NSCLC,的有效率低于,l5,，结果不尽人意，肿瘤细胞,CD55(DAF),高表达是抗体疗效不佳的原因之一。,补体与肿瘤,Meth-A,纤维瘤细胞和,MM46,乳腺癌细胞高表达补体调节蛋白,Crry,肿瘤细胞与抗,Crry/p65,抗体,(5D5),孵育，细胞,PBS,洗过后，用,FITC,标记的抗,IgG,抗体进行流式细胞检测。,分别皮下注射肿瘤细胞以及与抗,Crry/p65 IgG,抗体,(5D5),、抗,Crry/p65 F(ab)2,抗体孵育的肿瘤细胞小鼠生存率和肿瘤生长情况比较,Meth-A,纤维瘤细胞和,MM46,乳腺癌细胞，通过,Crry,中和抗体,5D5,预处理这些细胞系后，分别接种其同系小鼠,BALB/c,中，结果显示抗,Crry/p65 IgG,抗体组肿瘤生长明显受到抑制，抗,Crry/p65 IgG,抗体处理的,MM46,乳腺癌细胞组小鼠生存率明显提高，但抗,Crry/p65 IgG,抗体处理的,Meth-A,纤维瘤细胞组小鼠生存率提高不明显。,补体相关药物研究进展,SLE (lupus),（系统性红斑狼疮）,Rheumatoid arthritis,（类风湿性关节炎）,Multiple Sclerosis (,多发性硬化症,),Renal disease/nephritis,（肾病,/,肾炎）,Transplant rejection,（器官移植）,Cardiopulmonary bypass syndrome,（心肺旁路）,Myocardial infarction (,心肌梗死）,Septic shock,（败血症休克）,Ischemia and reperfusion injury,（缺血再灌注损伤,),Stroke,（中风）,多种系统补体抑制药物正在研制中,sCR1,和抗,C5,单抗已分别进入,、,期临床,存在问题,缺乏选择性和特异性,目前临床应用的大多数免疫抑制剂,缺乏选择性和特异性,，会影响机体正常的免疫应答；,系统性补体抑制物,虽然改善了局部炎症反应，但同时全身性的补体抑制，也会造成感染等副作用。,新的思路,CR2,靶向补体抑制物,能抑制局部炎症中的补体激活,靶向聚集于炎症部位，提高疗效,不影响补体在机体中免疫作用,降低毒副作用,CR2,结合于补体激活位点,补体抑制物,CR2,配体,针对补体激活位点的补体受体,2,（,CR2,）靶向补体抑制物,补体激活,炎症反应,CR2,补体抑制物,细胞表面沉积的,C3dg,、,iC3b,、,C3d,分子,CR2,靶向补体抑制物的构建、表达、筛选与鉴定,CR2,靶向补体抑制物亲和力的测定,CR2,靶向补体抑制物生物学活性的鉴定,CR2,靶向补体抑制物在,MRL/lpr,红斑狼疮小鼠中的治 疗作用,CR2,靶向补体抑制物在胶原诱导的类风湿关节炎小鼠中的治疗作用,前期实验研究,CR2,靶向补体抑制物的构建、表达、纯化与鉴定,图,1 CR2,靶向补体抑制物的构建图示（部分）构建通过,CR2 N,端连接补体抑制物的蛋白和通过,CR2 C,端连接补体抑制物的蛋白以及非靶向补体抑制物,CR2,靶向补体抑制物,CHO,高效表达株的筛选与鉴定,图,2,两种不同方法筛选的,CR2DAFGS-CHO,细胞系在不同条件无血清培养基中蛋白的产量,CR2,靶向补体抑制物体外靶向性的鉴定,-,CR2 N,端连接补体抑制物的靶向蛋白与其配体,C3dg,亲和力较高,图,3,通过,SPR,技术,分析,CR2,靶向补体抑制物和,C3dg,分子的相互作用亲和力的测定,CR2,靶向补体抑制物体内靶向性的鉴定,在炎症免疫损害部位高度聚集,图,4 24,周龄,MRL/lpr,肾炎小鼠肾组织切片免疫荧光,a:,尾静脉注射靶向补体抑制物,CR2DAF 24,小时；,b:,尾静脉注射可溶性补体抑制物,DAF 24,小时。证明：和非靶向补体抑制物相比，靶向补体抑制物可在免疫损害部位高度聚集。,CR2,靶向补体抑制物生物学活性的鉴定,-,抑制补体介导的细胞裂解的效能提高了,20,倍,图,5 CR2,靶向补体抑制物对补体介导的细胞裂解的抑制,CR2,靶向补体抑制物在小鼠肠道缺血再灌注,(IRI),急性炎症损伤模型中的作用,剂量效应关系,图,6 A,：,不同治疗剂量,下的肠道粘膜损伤计分,B,：,不同治疗剂量,下的肠道绒毛高度,CR2,靶向补体抑制物在小鼠,CLP,感染模型中的作用,副作用的评价,图,7 CR2,靶向补体抑制物和非靶向补体抑制物在小鼠,CLP,感染模型中存活率的比较 采用盲肠结扎穿孔,(cecal ligation and puncture,，,CLP),法制作腹腔感染脓毒症,C57BL/6,小鼠模型，分别注射单剂量,PBS (n = 18), CrryIg (1.0 mg; n = 8),和,CR2Crry(0.1 mg; n = 10),以及多剂量,CR2Crry (0.1 mg; n = 10),，结果显示：,CrryIg,组在,48,小时内全部死亡，,CR2Crry,组（不论是单次注射还是多次注射组）存活率明显提高，和,PBS,组相比未有明显差别；并且,CR2Crry,剂量低于,CrryIg 10,倍，,靶向补体抑制物比非靶向系统补体抑制物造成感染的副作用明显降低。,CR2,靶向补体抑制物在,BALB/C,小鼠中生物半衰期,-,生物半衰期（,t1/2,）约为,9h,图,6 CR2Crry,平均血清循环水平,BALB/C,小鼠注射，,ELISA,测定血清,CR2Crry,浓度，结果显示,CR2Crry,的生物半衰期（,t,1/2,）为,9h,。,CR2,靶向补体抑制物在系统免疫抑制的风险性远远低于非靶向补体抑制物,CR2,靶向补体抑制物在,MRL/lpr,红斑狼疮小鼠中的治疗作用,-,靶向肾脏炎症损害部位,图,7 16,周,MRL/lpr,小鼠,CR2Crry,在体内生物学分布 小鼠尾静脉注射,125,I-CR2Crry,后，,24h(A),、,48h(B),和,72h(C),体内主要器官的,125,I-CR2Crry,的分布，显示,CR2Crry,在肾脏高度聚集。,24h,48h,72h,CR2,靶向补体抑制物在,MRL/lpr,红斑狼疮小鼠中的治疗作用,-,靶向并持续作用于肾脏炎症损伤部位,图,8 CR2Crry,在,MRL/lpr,小鼠肾脏中定位（共聚焦显微镜免疫荧光染色）,16,周,MRL/lpr,小鼠尾静脉注射,0.25mg CR2Crry,后，,24h(A,，,B),、,48h(C,D),和,7d(E,F),分离肾脏制备切片，,A,、,C,、,E,为双色荧光叠加图；,B,、,D,、,F,为,DCI,荧光叠加图，绿色荧光为抗,CR2,抗体显示,CR2Crry,定位，显示在,24h,、,48h,和,7d,肾小球中,CR2Crry,均存在。,24h,48h,7d,CR2,靶向补体抑制物在,MRL/lpr,红斑狼疮小鼠中的治疗作用,-,改善了肾功能,图,9 MRL/lpr,小鼠,CR2Crry,治疗组和,PBS,对照组蛋白尿情况对比 在,第,22,周和,24,周时，与对照组相比，治疗组的蛋白尿水平明显降低（）。,CR2,靶向补体抑制物在,MRL/lpr,红斑狼疮小鼠中的治疗作用,-,减轻了肾脏的炎症反应,分组,肾小球积分,间质炎症,血管炎,新月体,/,坏死,对照组（,n=12,）,12.14.6,3.00.6,100%,50%,治疗组（,n=7,）,7.42.9,2.70.8,71%,12%,表,1 MRL/lpr,小鼠从,16,周到,23,周治疗后第,24,周,CR2Crry,治疗组和,PBS,对照组肾脏损害情况对比 和对照组相比，治疗组的,肾小球积分、血管炎和新月体,/,坏死等明显降低（）,但间质炎症两组未有明显差异（）。,CR2,靶向补体抑制物在,MRL/lpr,红斑狼疮小鼠中的治疗作用,-,降低了皮肤损害,图,10 MRL/lpr,小鼠从,16,周到,24,周,CR2Crry,治疗组和,PBS,对照组皮肤可见损害发生率（,A,）和皮肤损害累计病理总积分（,B,）情况对比 和对照组相比，从,18,周起治疗组的皮肤损害明显降低。,CR2,靶向补体抑制物在,MRL/lpr,红斑狼疮小鼠中的治疗作用,-,减轻了肺组织炎症,图,11 MRL/lpr,小鼠从,16,周到,23,周治疗后第,24,周,CR2Crry,治疗组（,B,n=7,）和,PBS,对照组,(A,，,n=10),肺组织,H&E,染色对比,CR2Crry,治疗组（,B,n=7,）和,PBS,对照组相比，炎症反应明显减轻。,MRL/lpr,小鼠从,16,周到,23,周治疗后第,24,周,CR2Crry,治疗组和,PBS,对照组肾小球中免疫球蛋白和补体分子沉积（免疫荧光染色）情况对比,和对照组相比，治疗组的肾小球免疫球蛋白和补体分子沉积明显降低。,CR2,靶向补体抑制物在,MRL/lpr,红斑狼疮小鼠中的治疗作用,-,提高了生存率,图,12 MRL/lpr,小鼠从,16,周到,24,周,不同剂量,CR2Crry,治疗组（,n=16),和,PBS,对照组,(n=20),小鼠生存率的对比 和对照组相比，从,19,周起治疗组的小鼠生存率明显提高。,CR2,靶向补体抑制物在胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠中的治疗作用,-,明显改善临床症状,图,13,胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠相同剂量不同治疗次数组临床症状评分,从第,25,天至,35,天，,CR2Crry,三个治疗组,（,次,/,只）的关节炎严重程度明显低于,PBS,组（）；右边小鼠为,CR2Crry,治疗组，左边为,PBS,组。,CR2,靶向补体抑制物在胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠中的治疗作用,剂量效应关系,图,9,胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠,不同剂量治疗组,临床症状评分,治疗组和,PBS,组以及和治疗组之间不存在显著统计学差异（）,但治疗组和,PBS,组之间存在显著统计学差异（）。可能只剂量适合。,CR2,靶向补体抑制物在胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠中的治疗作用,-,降低了小鼠膝关节炎性因子水平,图,14,小鼠膝关节细胞因子水平的测定：通过定量,PCR,检测小鼠膝关节细胞因子,mRNA,水平，发现,TNF,和,IL-1,水平在,CR2Crry,治疗组（,7,次和,1,次）明显低于,PBS,组（）。,IL-1Ra,和,IL-10 mRNA,水平在,CR2Crry,治疗组（,7,次）明显高于,PBS,组（）。,CR2,靶向补体抑制物在胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠中的治疗作用,-,降低了关节组织的炎性反应,图,15,关节组织病理检查,各组小鼠于第,21,天给药，第,35,天取关节，脱水脱钙后行石蜡包埋切片，,HE,染色。和,PBS,组（,c,d,）比较，,CR2Crry,治疗组（,7,次）小鼠关节部位炎性细胞浸润均不明显，滑膜增生轻微，无明显软骨破坏及骨浸润等。,a,b,c,d,近年补体研究进展,-,年龄相关性黄斑变性（,AMD,）,2005,年,4,月,科学,三项独立的研究发现了同一个基因 ：补体因子,H (complement factor H),基因上两个遗传标记（,SNP),与白种人老年黄斑变性有很强遗传相关性；变异使其携带者患,AMD,的风险增加了,3,到,7,倍。,2007,年,8,月,新英格兰医学杂志,：一个,C3,变异体与,AMD,显著相关 。,研究者指出：“这些发现增强了我们对年龄相关性黄斑退行性变遗传学的认识，并且为补体途径在这种常见和严重疾病发病机理中起重要作用提供了结论性证据。”,患,AMD,后视力受损,正常视力,2007,年,9,月美国和瑞典的两个研究小组在,新英格兰医学杂志,上发表论文，其分别独立鉴定出两个类风湿性关节炎相关基因,TRAF1,和,补体分子,C5,基因,，这两个基因负责控制人体内与类风湿性关节炎相关的慢性炎症过程。,近年补体研究进展,-,类风湿关节炎（,RA,）,2006,年,11,月,Nature,杂志发表三篇集中在,C3b,结构的研究文章，都主要是透过对,C3b,结构的分析获得对补体系统的了解。,来自荷兰乌特列支大学,(Utrecht University),和美国宾州大学，,Genetech,公司，以及美国阿拉巴马州大学的三支研究队伍都从,C3b,结构入手发现了补体系统的不正确激发，与包括关节炎、哮喘、红斑狼疮、自免疫心脏病和多发性硬化等疾病有关，这也是朝着设计操控补体系统的治疗方法迈出了一步。,近年补体研究进展,-,C3b,分子结构解析,新的补体受体,- CRIg,新的激活分子,-SIGN-R1,新的逃逸机制,第,21,届国际补体大会,于,2006,年,10,月,23,日在北京饭店召开，也是我国首次举办这一会议，由国际补体学会和卫生部人才交流中心共同主办，来自,22,个国家的近,300,名代表参加了本届会议。此次举行的第,21,届国际补体大会是国际补体研究领域规模最大、水平最高的学术会议。,补体是免疫反应的重要角色,：,补体不仅能直接引起免疫反应，而且还是获得性免疫被激活的重要中间物质，在试验中，当补体或其他天然免疫系统缺失后，即便是接触相同的感染源，一些原本能够发生的获得性免疫也没有了。因此，补体在人体免疫反应中所起的作用，要比人们原来想象的重要得多。,补体抑制剂将进临床：,过去几年的一项重要研究就是寻找补体抑制剂，用它做成的新药将有望通过抑制补体减轻缺血再灌注的损害。,激活补体可能治肿瘤,：,引导补体攻击肿瘤细胞，通过自然免疫抑制肿瘤生长。,第,22,届 国际补体大会,于,2008,年,9,月,28,日在瑞士巴塞尔举行：,rC3-1,用于治疗罕见的慢性血液病阵发性睡眠性血红蛋白尿症,(PNH),；,针对,C3,损耗的疗法潜力已经在黄斑变性、哮喘、风湿性关节炎以及自体免疫和炎性疾病中得到了验证。此外，,C3,损耗还被证明是手术、移植以及癌症治疗的一种有效辅助疗法。,第,23,届 国际补体大会,于,2010,年,8,月,1,日在美国纽约举行：,TT30 in PNH, TT32 in Heart Transplant, TT33 in Liver Transplant,补体分子与其他分子在先天免疫与获得性免疫中复杂的相互作用,Thank You!,汇报结束,谢谢大家,!,请各位批评指正,