农学植物胚胎培养

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,植物胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养和试管受精等内容。,植物胚胎培养,植物胚胎结构,一、胚胎培养概念,1、胚胎培养,指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。,广义胚胎培养研究还包括胚乳培养和试管受精等技术。,胚电镜扫描图片,2、胚培养,指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法。,双子叶植物胚,3、胚乳培养,指处于细胞期的胚乳组织的离体培养。,4、胚珠培养,指未受精或受精后的胚珠离体培养。,不同植物的胚珠形态结构,倒生胚珠,5、子房培养,指授粉和未授粉的子房培养。它对于研究果实发育的生理、离体受精等有重要意义。,6、试管受精,指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉进入胚珠而完成受精过程。,二、胚胎培养的应用,1、克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物,2、打破种子休眠，提早结实，缩短育种年限,3、使生活力低下或无生活力的种子萌发,4、使柑橘类植物合子胚正常发育,5、测定种子生活力,6、获三倍体或单倍体植株,7、快速繁殖特殊植物,8、用于理论研究,指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法。,三、胚的培养,植物胚结构,胚电镜扫描图片,双子叶植物胚,图示为胚珠和胚囊的发育过程,孢原细胞,减数分裂,（大孢子母细胞）,中央细胞,幼胚培养,成熟胚培养,据培养目的不同,剥取的离体胚发育时期的不同,胚培养,成熟胚培养一般较易获得成功,（一）幼胚培养,幼胚完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。,幼胚培养的关键技术：,取材时期,幼胚剥离,培养条件的控制（是否需要特殊处理）,幼胚培养时，其发育过程有以下几种,发育方式：,a、胚性发育，此种方式不能萌发成苗,b、早熟萌发，长成的苗十分瘦弱,c、产生愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚或不定芽,(1)、胚性发育(embryonal development) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。,幼胚离体培养的生长发育方式,(2)、早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。,(3)、愈伤组织(callus) 在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。,（二）成熟胚培养,成熟胚是自养的，培养基需要简单。主要目的:,研究胚发育过程的形态建成,生长调节物质的作用,胚与胚乳相互关系和营养要求,培养方法：,A、将受精后成熟或未成熟种子或果实，用70%75%酒精表面消毒消毒几分钟,B、用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水反复冲洗,C、无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥取胚接种在培养基上,胚龄,胚长度（,m）,营养需要（培养基营养）,早球形胚,后球形胚,心形胚,鱼雷胚,成熟胚,2060,6180,81450,451700,700（,最大极限,）,小于40,m长的胚所需营养尚不清楚,大量元素、微量元素、V,B1,、V,B6,、烟酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L,大量元素、微量元素、V,B1,、V,B6,、烟酸、糖2%,Ca（NO,3,）,2,480mg/L、KNO,3,63mg/L、KCl 42mg/L、MgSO,4,63mg/L、KH,2,PO,4,42mg/L、V,B1,、V,B6,、烟酸、糖2%,Ca（NO,3,）,2,480mg/L、KNO,3,63mg/L、KCl 42mg/L、MgSO,4,63mg/L、糖2%,荠菜不同发育时期胚培养的营养需要,胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。由它可获得无子结实的3倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。,不同胚乳发育类型及发育时期直接影响外植体取材时期以及胚乳细胞产生愈伤组织频率。,胚乳培养的后代，常发生细胞染色体数目变化，形成多倍体、非整倍体等。,四、胚乳培养,1、核型胚乳,被子植物中普遍的胚乳发育形式,初生胚乳核的第一次分裂和以后的多次分裂，都不伴随壁的形成,各个胚乳核呈游离状态分布在胚囊中,发育到一定阶段后，常在胚囊外围的胚乳核之间出现细胞壁,为单子叶植物和具有离瓣花的双子叶植物中普遍存在，如小麦、水稻、玉米、棉花、油菜、苹果等,（一）,胚乳的发育类型,2、细胞型胚乳,特点：,初生胚乳核的分裂开始，即产生细胞壁，形成胚乳细胞,无游离核时期,大多数双子叶合瓣花植物是这样的胚乳，如番茄、烟草、芝麻等。,3、沼生目型胚乳,核型胚乳与细胞型胚乳的中间类型,初生胚乳核的第一次分裂将胚囊分隔为两室，其中珠孔端室比合点端室宽大,核进行分裂形成状态的游离核，最后形成细胞,（二）胚乳培养的关键,A、胚乳发育时期的影响,发育早期胚乳：操作不便，诱导率低,游离核期或刚转入细胞期的核型胚乳：难得callus,旺盛生长期胚乳：易诱导产生callus, 旺盛期胚乳特征,胚已分化完成,胚乳已形成细胞组织,充分生长，达到成熟大小,外观为半透明的固体状,富有弹性,水稻：授粉后4 d 黑麦草：授粉后8 10 d,黄瓜：授粉后7 16 d 梨：授粉后20 d,大麦：授粉后10 20 d 玉米和小麦：授粉后8 12 d,一些草本植物胚乳培养的适宜取材时期,一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus诱导率很低，甚至无callus,木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱导产生callus,B、培养基和激素的影响,培养基：MS、B,5,、MT、White、LS等,水解酪蛋白、酵母提取物也很必要,激素：要求特殊,大麦胚乳只有在添加2，4-D的培养基上才能生长,猕猴桃胚乳培养中，玉米素最好,枣的胚乳培养中，激素似乎无特殊要求,C、其他因素的影响,蔗糖浓度：3% 5%,温度：25,pH值：如 玉米 6.1 7.0 ； 苹果 6.0 6.2等,（三） 培养方法：,A、取授粉4-8d后的幼果，常规消毒,B、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳,C、接种在培养基上，在25-27和黑暗条件或散射光下培养形成愈伤组织,D、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下不定芽,E、插入生根培养基中，光下培养10-15d，切口处长出白色的不定根,两种植物胚乳培养的方法,A、枸杞,开花20d的枸杞胚乳 MS + 2，4-D 0.2mg/L,生根 MS 分化出苗 MS + BA 0.2mg/L,不同倍性的胚乳植株,callus,B、葡萄,取出种子 切去合点部分,接种,White + CM10% + 2，4-D 2.0 + CH 500 +KT 1.0 + 蔗糖 3%4%,琼脂8%,1个月，胚乳愈伤组织长大，胚解体,未授粉胚珠和子房培养是离体受精的基础，可诱发大孢子发育成单倍体植株，且孤雌产生的单倍体植株获得率较孤雄生殖高。,胚珠培养中，已授粉具有球形胚或更后期的胚珠易培养成种子，且培养基及添加成分相对要求不高。而受精不久的胚珠则需要成分复杂的培养基，培养难度大。,五、胚珠和子房培养,1、胚珠培养的意义,有利于合子和早期原胚的培养,胚分化不全的种子的胚培养,获得杂交后代和优良品种,离体授粉的需要,获得无病毒苗,（一） 胚珠培养,2、胚珠培养的方法,长度小于3mm的胚珠，难与直接解剖，可先接种于液体培养基中，根据培养情况采取相应培养条件。,（二） 子房培养,1、子房培养的意义,有效地挽救杂种胚的败育,单倍体植株的培育,离体授粉的需要,离体条件形成果实,花被功能研究,2、子房培养的方法,授粉前或授粉后的子房,表面消毒,接种培养,受精后的子房仍需进行表面消毒后再接种。而未受精子房可将花被表面消毒后，在无菌条件下直接剥取子房接种。,子房培养只需较简单的培养基即可形成果实，并含成熟种子。,六、植物离体授粉受精,离体受精（,IVF,）,指在离体环境中完成,被子植物,的精、卵融合而且利用受精所产生的“离体合子”培养再生植株，做到整个受精与胚胎发育过程完全在离体条件下完成。（90年代）,离体受精技术的突破的技术前提：,a、雌配子和雄配子分离技术,b、单对原生质体融合技术,c、微培养技术（,将商品生产的微室置入饲养细胞的小培养皿中，培养物接微室内，通过室底部微孔滤膜吸取周围,饲养细胞,释放的活性物质，促进其发育）,开花前数天套袋，开花前一天或当天取花蕾或花药，表面消毒后，无菌条件下收集花粉。,采用直接引入法、注射法进行子房试管授粉，或者是采用哺育法、接近法进行胚珠试管授粉。,1、离体受精方法,胚珠,花粉,试管内授粉,10d后,胚珠培养,3周后,离体受精及植株再生过程,2、技术关键,A、花粉的采集和灭菌,确定开花、花药分裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精作用时间,去雄后将花蕾套袋隔离,采集花粉粒,消毒,无菌条件分裂花粉,授粉,B、外植体选择,开花前套袋、去雄,开花后1 2d，采集花蕾，放入无菌室培养准备,切去柱头，防止不授粉,胚珠剥离时间（开花后1 2d效果好）,C、适合的培养基,离体受精的主要过程,花粉的萌发和花粉管的生长，受精,受精胚珠发育为成熟的种子，存在生活力的胚,培养基应促进受精后的胚珠正常发育,离体受精胚珠培养的改良Nitsch（1951）培养基配方,成分,数量（mg/L）,成分,数量（mg/L）,成分,数量（mg/L）,Ca（NO,3,）,2,4H,2,O,500,ZnSO,4,7H,2,O,0.5,V,B1,0.25,KNO,3,125,MnSO,4,4H,2,O,3.0,V,B6,0.25,KH,2,PO,4,125,H,3,BO,3,0.5,烟酸,1.25,MgSO,4,7H,2,O,125,FeC,6,O,5,H,7,5H,2,O,10.0,蔗糖,50 000,CuSO,4,5H,2,O,0.025,Gly,7.5,琼脂,7 000,Na,2,MoO,4,0.025,泛酸钙,0.25,蔗糖浓度是4% 5%，水解酪蛋白为500mg/L，利于花粉萌发和种子发育,3、离体受精障碍,花粉在柱头上不萌发,花粉管不能进入胚珠,花粉在花柱中破裂,受精后，胚和胚乳之间的不亲和性,受精后，胚乳发育不良,杂种胚不能发育成熟,4、,离体受精的细胞学研究现状,（1） 配子识别判别糖蛋白的作用,利用分离的雌、雄配子对其细胞膜特征，如表面膜蛋白,特别是糖蛋白的分布等直接进行分析，这可以帮助判断,糖蛋白在被子植物中是否和在动物及低等植物中一样是,配子识别必不可少的；,（2） 膜融合多精入卵问题的探讨,膜融合的方式，在不同的离体受精系统中融合的原理是 不同的，一种是精细胞质很快进入卵细胞，精细胞膜作 为其中的一部分参与了受精卵细胞膜的重组。另一种是 精细胞整体进入卵细胞，精细胞膜并不参与融合产物细 胞膜的形成。,（3） 胞质融合精细胞质全部进入卵细胞,体内自然受精过程中，至少部分被子植物的精细胞质未能进入卵细胞；而在离体受精时，精细胞质则全部进入卵细胞 。,（,4）核融合融合过程中的信号问题,核融合一般在精卵融合后,35-90min,出现 。烟草卵细胞有明显的极性即液泡端和胞质端，但无论精子在卵细胞哪一端融合，卵细胞质都可很快地移向精核处将其纳入并包被。,七、影响因素,1、胚珠（子房）的成活率及育龄,离体胚珠（子房）培养的成活率直接影响试管受精的成功率。,胚珠（子房）离体成活率的关键是培养基成分的筛选。,2、母体组织的影响,柱头可影响某些植物受精，应切除柱头和花柱。,而有些植物则需要保留，更有利于离体受精，如烟草。,3、花粉萌发和花粉管生长,离体花粉萌发率和花粉生长速度直接影响试管受精成功率。,