生物学DNA甲基化课件

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DNA,甲基化：在,DNA,甲基转移酶,(DNA methyltransferase,DNMTs),的作用下，将一个甲基添加的胞嘧啶的,5-,碳分子上，形成,5-,甲基化胞嘧啶,(5-methylcytosine),2.,胞嘧啶甲基化后产生,5-,甲基化胞嘧啶能够自发的脱氨基形成胸腺嘧啶,(Thymine),：,5mC - T,3.,哺乳动物中，,1%,的,DNA,碱基能够发生甲基化修饰,4. DNA,甲基化的分布：,(1),转座子,(2),逆转录病毒衍生的重复序列,(3),大多数功能基因的编码区,一、,DNA,甲基化,(2),1. DNA,甲基化的模式：,(1),线虫：无甲基化的胞嘧啶,(2),果蝇：极少量的甲基化胞嘧啶，识别模式,CpT (,主要,) vs. CpG (,极少,),(3),哺乳动物：,CpG,(70%),或者,CpNpG,2.,CpG Cytosine phosphate Guanine,3.,镶嵌的甲基化,(mosaic methylation):,基因组中，高度甲基化的部分,DNA,序列被大的非甲基化,DNA,序列所分隔开,4.,难以被,DNA,修复系统所识别：,CGTG,是可遗传的,CpG,岛的甲基化,(1),1. CpG,岛：富含,CpG,区域，长度,5001000bp,，,GC,含量超过,55%,2.,非随机出现：,60%,的编码基因的,5UTR,区域（转录起始区域）含有,CpG,岛。,3. CpG,的含量：,CG,出现的期望值（百分比）：,1/16 = 6.25%,观察值：很少（,1%,）,原因：,CG,具有很高的突变率,4. C-T,转换率是其他碱基对转换率的,10-40,倍以上,5.,例如：人类肿瘤细胞中的,p53,基因，,50%,的点突变都发生在,CpG,上。,CpG,岛的甲基化,(2),1. CpG,在重复片段以及基因的,3UTR,区域能够发生甲基化,2. CpG,岛通常不被甲基化,3.,哺乳动物中：,26,000-45,000 CpG,岛。常分布在持家基因和一些组织表达特异性基因的启动子区域,4. CpG,岛：可以被,Hpa,II,酶,(C|CGG),切成小片段，因此也叫,HTF,岛,C 5mC T?,Deamination,去氨基化反应,基因组甲基化的特点：,可逆性许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新甲基化或去甲基化；,组织特异性不同的组织细胞具有不同的甲基化模式，为基因表达设定程序。,异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化 ，前者指正常组织中不发生甲基化的位点被甲基化 ，后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化。,DNA,甲基化的检测,A,基因组甲基化水平,(Methylation Content),的分析,高效液相色谱,高效毛细管电泳法,B,候选基因,(Candidate Gene),甲基化分析,甲基化敏感性限制性内切酶,-PCR/Southern,法,重亚硫酸盐测序法,甲基化特异性的,PCR,甲基化荧光法,(MethyLight),焦磷酸测序,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,C.,基因组范围的,DNA,甲基化模式与甲基化谱分析,限制性标记基因组扫描,甲基化间区位点扩增,甲基化,CpG,岛扩增,差异甲基化杂交,由连接子介导,PCR,出的,HpaII,小片断富集分析,甲基化,DNA,免疫沉淀法,高效液相色谱,HPLC,是一种比较传统的方法，是根据,DNA,或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增高。故而能够定量测定基因组整体水平,DNA,甲基化水平。该方法由,Kuo,等,1980,年首次报道。过程是将,DNA,样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算,5 mC/(5mC+5C),的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测,DNA,甲基化水平的标准方法。,高效毛细管电泳法,这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。用,HPCE,方法处理,DNA,水解产物来确定,5mC,水平，简便，经济且敏感性高。,重亚硫酸盐测序法,该方法首先用重亚硫酸盐使,DNA,中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，,PCR,扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对,PCR,产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否,CpG,位点发生甲基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每一个,CpG,位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。,Bisulfite Modification,测序,:,非甲基化的,C,将被测序成,T,，反链为,A,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,(combined bisulfiterestriction analysis, COBRA),这种方法对标本,DNA,行重亚硫酸盐处理及,PCR,扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后,PCR,产物切割的特性以识别原标本,DNA,的甲基化状况。该方法相对简单，不需预先知道,CpG,位点及样本序列。,甲基化,DNA,免疫沉淀法,(Methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP),这是一种高效富集甲基化,DNA,的方法。在该方法中，可与,5mC,特异性结合的抗体加入到变性的基因组,DNA,片段中，从而使甲基化的基因组片断免疫沉淀，形成富集。通过与已有,DNA,微芯片技术相结合，从而进行大规模,DNA,甲基化分析。该方法简便，特异性高，适合,DNA,甲基化组学,(DNA Methylome),的分析。,DNA,甲基化位点鉴定的方法,DNA,甲基化的功能,1.DNA,甲基化可以引起基因组中相应区域的染色质结构变化，使,DNA,失去,DNA,酶的敏感位点和限制性内切酶的切割位点。,2.DNA,甲基化可使染色质高度螺旋化，凝结成团，失去转录活性。,宿主防御模型,(The Host Defence Model),基因调控模型,(The Gene Regulation Model),宿主防御模型,1.,转座子的甲基化,2.,人类基因组,45%,的区域是转座子,3.,高度甲基化，细胞中,90%,的甲基化,CpG,位于转座子中,4.,转座子的活性：对机体非常有害,5.,宿主防御模型：抑制转座子的活性,转座子导致的,PEV,基因调控模型,1. DNA,甲基化的主要功能：转录沉默,(silencing transcription),(1),基因的启动子区域通常不被甲基化修饰,(2),建立特定的基因表达模式：组织特异性、生殖特异性,(3),基因印记、,X,染色体失活,2. DNA,甲基化抑制基因转录的机制：,(1),干扰转录因子对,DNA,元件的识别和结合,(2),将转录因子的,DNA,识别序列转变为阻抑物的识别序列,(3) DNA,甲基化有利于招募染色质重塑或修饰因子,3. DNA,甲基化：是转录沉默的结果和维持，而不是原因,DNA,甲基化抑制基因转录的机制,Long-term,silencing,直接干扰机制,(1),直接干扰机制,(2),间接机制,The methyl-CpG-binding proteins,MeCP1 and MeCP2,能够与甲基化的,DNA,结合,MeCP2,能够招募,Sin3a,HDACs,，形成复合物，阻遏转录,MeCP2,二、真核生物的,DNA,甲基转移酶,1.,哺乳动物,: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B,，,DNMT3L, DNMT2,2.,拟南芥：,DRM2, MET1,，,DNMT2, CMT3,3.,粗糙脉孢菌,(Neurospora crassa): DIM2,dim-5, RID,DNA,甲基转移酶,DNA,甲基转移酶：系统发育分析,哺乳动物的,DNA,甲基转移酶,DNMT1:,maintenance methyltransferases,DNMT3A & DNMT3B:,de novo,methyltransferases,胚胎移植过程中高表达,DNA,甲基化与去甲基化,DNA,甲基化的维持：两种模型,PCNA:,在染,色体上滑动,UHRF1,：,特异性的与,半甲基化位,点结合,表观遗传修饰的重编程,配子形成 胚 胎植入前的发育,DNA,甲基化：,Cell Memory,DNA,甲基转移酶的功能,DNA,甲基化的通路：哺乳动物,启动子的甲基化,(a),未知蛋白质因子,X,失去，,DNMT,结合，促使启动子甲基化,(b),聚合酶失去，,DNMT,结合,-,甲基化,(c),某些转录因子招募,DNMT,到启动子区域，促使甲基化,(d),组蛋白甲基转移酶,(HMT),招募,DNMT,DNA,甲基化的通路：拟南芥,1.,拟南芥中大多数全新甲基化由,siRNA,介导,2. DRM2: de novo; MET1:,Maintenance,DNA,甲基化：哺乳动物,VS,植物,DNA,甲基化的通路：粗糙脉孢菌,1. RIP:,repeat-induced point mutation,Dnmt 1,1. Dnmt1chip/-: Dnmt1,的表达量为正常小鼠的,10%,；,2.,低甲基化,3. Dnmt1chip/-,小鼠出生体重为正常的,70%,4. 80%,的小鼠,4-8,个月内产生淋巴瘤,5.,癌基因,c-myc,表达量异常增高,Dnmt3b,1.,小鼠胚胎纤维原细胞中的,Dnmt3b,失活导致,DNA,的低甲基化,(Hypomethylation),，染色体不稳定，使癌症细胞永生化,2.,形成有丝分裂染色体桥,3.,转入,Dnmt3b,能够恢复表型,Dnmt3a & Dnmt3b,表达特异性：,Dnmt3a: ubiquitous,普遍存在,Dnmt3b:,前额，眼睛,Dnmt3a & Dnmt3b,对哺乳动物的发育至关重要,三、,DNA,去甲基化,1. DNA,去甲基化,(DNA demethylation): 5,甲基胞嘧啶,(5mC),替代成胞嘧啶的过程,2.,两种方式,(1),主动去甲基化,(Active DNA demethylation),A.,Bona fide,demethylation,B. Indirect demethylation,(2),复制相关的去甲基化,(Replication-coupled DNA demethylation),Active DNA demethylation,1. 5-,甲基胞嘧啶去甲基化酶将,5-,甲基胞嘧啶水解成胞嘧啶和水,2. 5-,甲基胞嘧啶,/DNA,糖基化酶将,5-,甲基胞嘧啶从磷酸二脂键骨架中切除，然后通过内切酶修复,5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶,5-,甲基胞嘧啶去甲基化酶,1. 1999,年，,A549,细胞中提取，,MBD2,；,2.,需要很高的能量：使,O-H,键和,C-C,键断裂之后，再形成,C-O,键和,C-H,键,3.,从热动力学上可行,5-,甲基胞嘧啶去甲基化酶,Bona fide,demethylation,+,二氧化碳,+,琥珀酸盐,+,甲醛,+,甲醇,5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶,1. MBD2b: MeCP2,的同源蛋白质,把MBPD与绿色荧光蛋白连起来（融合），相当于给MBPD加上了一个荧光标签，可以在显微镜下直接观察和追踪MBD的位置。,一般情况下，MBPD-GFP是与基因组上甲基化的DNA结合，在在荧光显微镜下呈现绿色的斑点；,在基因组甲基化被清除时，MBPD-GFP就无处可以结合，因此就分散在细胞核内，在显微镜下，原来那些绿色荧光斑点消失，而变成了弥散的绿色。,这样通过观察荧光信号的变化来判断基因组甲基化的变化。,Indirect demethylation,Replication-coupled DNA demethylation,甲基化酶活性的维持,甲基化酶活性被关闭,甲基化酶活性被,抑制,去甲基化酶,哺乳动物体内,可能,存在去甲基化的酶，这种酶,可能,为一种糖基化酶、核酸内切酶或真正的去甲基化酶。,2007年，海德堡的发育生物学家Niehrs在Nature上发文报道一个DNA损伤诱导蛋白Gadd45a促进DNA去甲基化。,美国加州贝克曼研究所的Pfeifer 实验室在PLoS Genet.上发文否定Niehrs的结果，题目针锋相对：GADD45A does not promote DNA demethylation。,DNA 去甲基化的机理,后来相继有几篇来自不同实验室的报道肯定了Niehrs的结果。仅管如此，还是有些问题：,Gadd4a基因敲除病不妨碍胚胎发育，也不会影响受精卵分裂前的去甲基化过程。,2. Gadd4a 其实并不是真正的去甲基化酶，它只是启动核酸切除修复（主要用来修复紫外线对DNA的损伤），把一段甲基化的DNA切了，重新合成新链。但在全基因组水平上用切除DNA的方法进行甲基化重塑貌似不合理。,2010年，剑桥的M. A zim Surani和Wolf Reik先后在Nature和Science上报道，AID（胞嘧啶核苷脱氨酶）基因敲除的精子的去甲基化受到显著影响。,甲基胞嘧啶通过脱氨作用形成的尿嘧啶，尿嘧啶只能在RNA出现，如果在DNA出现，细胞会触发碱基切除反应。,他们都证实AID参与的去甲基化是通过对甲基化胞嘧啶的脱氨作用启动碱基切除修复完成的。,DNA 去甲基化的机理,2009年，斯坦福大学医学院的院士Helen M. Blau证明诱导哺乳动物iPS需要AID蛋白参与启动细胞的DNA去甲基化，并启动细胞核重新编程过程。,为了研究iPS诱导过程中的相关机制，他们构建了一个异核体细胞（融合了小鼠胚胎干细胞和人类成纤维细胞），这种异核体诱导的速度比正常的体细胞诱导速度快很多，仅需1天时间，诱导效率高达70%。,用RNAi进行扫描发现，异核体诱导启动依赖一种蛋白，这种蛋白就是AID。,AID不仅促进细胞重排过程中的去甲基化，更是可以诱导OCT4和NANOG基因的表达（2种iPS诱导过程中的转录因子）。,AID蛋白对成纤维细胞上的OCT4与NANOG发挥作用，对胚胎干细胞不发挥作用。,利用RNAi筛选系统寻找DNA去甲基化酶,2009年，张毅实验室设计了一个能检测活细胞基因组DNA甲基化状态方法，并用受精卵细胞进行筛选，拿到了一个效果肯定的候选基因转录延长因子ELP3。,四、,DNA,甲基转移酶抑制剂,1.,核苷类,DNA,甲基转移酶抑制剂,2.,非核苷类,DNA,甲基转移酶抑制剂,核苷类,DNA,甲基转移抑制剂,1. 5-azacytidine:,第一个发现的甲基化抑制剂。有细胞毒性，低剂量能够治疗白血病,2. 5-aza-2,-deoxycytidine(5-,氮杂,-2-,脱氧胞嘧啶核苷,):,诱导细胞增生的停止,3. Zebularine(,2-,嘧啶肌苷,),：,5-azacytidine,的衍生物,4. FCDR,：,5-Fluoro-2-deoxycytidine(,氟脱氧胞苷,),作用机理：在体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷，在,DNA,复制过程中代替胞嘧啶，与,Dnmts,具有很强的结合力,(suicide substrates),。,非核苷类,DNA,甲基转移抑制剂,1. EGCG(,表没食子儿茶素没食子酸酯,):,绿茶中的聚苯复合物,2. RG108:,小分子，阻遏,Dnmt,的活性中心,3. 4-amino-benzoic acid(,4-,氨基苯甲酸异丙酯,),衍生物,: Procainamide,(,普鲁卡因胺,),4. Psammaplins(4-amino-benzoic acid,的衍生物,),5.,寡聚核苷酸：,MG98,抑制剂的抑制机理,抑制剂的抑制机理,性成熟个体,配子母细胞,成熟配子,早期胚胎,成体模式的胚胎,体细胞,生殖细胞,原始生殖细胞,甲基化清洗,印记,保持印记,部分保持印记,保持印记,保持印记,甲基化清洗重塑,X染色体失活，基因的时空特异性表达,甲基化异常,导致的疾病，,衰老,