免疫组化技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组化技术,Immunohistochemistry Technique,41107107贺盈梅,41107110刘丽娜,41107111张雪萌,免疫组化技术,免疫组化技术：指应用标记的特异性抗体在组织细胞,原位,通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性、定量检测的技术。,免疫组化技术,基本原理,ABC法,SP法,注意事项,应用实例,基本原理,抗原和抗体的结合具有高度的特异性，免疫组化技术正是利用这一特性，先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大。,免疫组化技术,由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。,通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。,免疫组化技术,显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀。,ABC法,（Avidin-Biotin-Peroxidase ）,即卵蛋白素-生物素-过氧化物酶复合物法,操作步骤：,1、防脱片剂处理载玻片：可选择APES（3-氨丙基-乙氧基甲硅烷,）或Poly-Lysine（多聚赖氨酸 ）(浸泡5分钟，601小时或室温过夜).,2、贴片，-80保存（或常温保存石蜡切片）,3、脱蜡（时间根据室温以及切片大小而定）,二甲苯 2-5分钟,二甲苯 2-5分钟,100%乙醇 1分钟,95%乙醇 1分钟,80%乙醇 1分钟,70%乙醇 1分钟,自来水洗 1分钟,蒸馏水 1分钟,免疫组化技术,4、纯丙酮4固定30分钟，蒸馏水洗干。,5、加入含0.5%过氧化氢的纯甲醇溶液，室温浸泡30分钟，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，PBS浸泡。,6、抗原修复液（枸橼酸盐缓冲液pH6.0,）92-98处理10-15分钟，室温冷却15-20分钟，蒸馏水洗2次。,7、滴加消化液（0.25% Trypsin胰蛋白酶）10分钟，蒸馏水洗2次。,8、滴加正常兔血清封闭液，室温20分钟。甩去多余的液体，不能水洗。,免疫组化技术,9、滴加适当稀释的一抗（1%BSA-PBS稀释），37，30-60分钟或室温120分钟或4过夜，需PBS洗。,10、滴加生物素标记的二抗IgG，20-37，20分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。,11、滴加HRP（或AP）标记的链亲和素，20-37，20分钟。0.01M PBS洗4次，每次5分钟。,12、DAB显色（或BCIP/NBT）。一般为5-30分钟。,13、脱水，透明，封片（中性树脂）。显微镜观察。,免疫组化技术,一抗,二抗,ABC,DAB,ABC,SP法,（streptavidin-perosidase,）,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法,操作步骤:,1.烤片，68，20分钟,2.常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；,二甲苯I 20min,二甲苯II 20 min,100%酒精I 10min,100%酒精II 10min,95%酒精5min,80%酒精5min,70%酒精5min,3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%过氧化氢 37孵育10min，PBS冲洗3X5min；,免疫组化技术,4.抗原修复:置枸橼酸缓冲液（）中用煮沸（95，1520min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。,5. 正常羊血清工作液封闭，3710 min，倾去勿洗.,6. 滴加一抗4 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗, 37孵育30min, PBS冲洗3X5min;,7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37孵育30min, PBS冲洗3X5min;,8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。,免疫组化技术,SP,Primary Antibody,Biotinylated,Secondary Antibody,Ensyme-conjugated,Streptavidin,Substrate-chromogen,solution,免疫组化技术,在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此SP法比ABC法更敏感,Sp method,注意事项,免疫组化技术中由于操作步骤繁杂，对切片以及各种试剂的要求较高，在任何一环节的不当操作都可能会造成后面镜检时的困扰，可能切片上没有任何信号，又或者会有假阳性或假阴性的现象发生。,免疫组化技术,假阳性原因：,内源酶及内源性生物素,（要将原组织中的内源酶灭活）,抗体本身原因,（使用单克隆抗体）,切片制作不当,（避免组织对抗体的非特异性吸附）,冲洗不充分,（,用含盐的缓冲液充分冲洗，可利于减低背景着色）,DAB显色产生背景着色,（除去DAB的不溶性颗粒， DAB要保存妥当，防止,其氧化产物沉淀在组织上）,免疫组化技术,假阴性的原因：,抗原的丢失,（及时固定标本，严格控制浸蜡时间和温度）,抗原的遮蔽,（进行抗原修复包括用蛋白酶消化）,抗体试剂因素,（抗原抗体间要相互匹配）,操作不当,（严格按照操作步骤进行）,应用实例,由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，伴随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。,免疫组化技术,1、确定细胞类型；,2、辨认细胞产物；,3、了解分化程度；,4、鉴定病变性质；,5、发现微小转移灶；,6、探讨肿瘤起源或分化表型；,7、确定肿瘤分期,8、指导治疗和预后,9、辅助疾病诊断和分类,10、寻找感染病因,Thank you for your attention!,Thats all!,