克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用,Clinically Suspicious LN,Biopsy,Morphology with IHC,If necessary,Molecular Dx,Cytogenetics/,FISH,Evaluation of the Suspicious Lymph Node,Carcinoma v. Lymphoma,FNA,With Flow Cytometry,Suspect Lymphoma,Carcinoma,CLL,Suspect Lymphoma,Negative or,Non-diagnostic,Workup for,Primary,Diagnosis,Staging and Treatment,FISH,Treatment,NCCN NHL Lymphoma Guidelines,（,5-10%,）,分子和细胞遗传学异常,抗原受体基因的克隆性重排,与类型相关的染色体异常,简要原理,检测方法,应用和策略,注意事项,淋巴细胞表面受体,IG,：,IGH,（,14q32),IGL, (2q12), (22q11),TCR:,TCR 14q11,TCR 7q32,TCR 7p15,IG,和,TCR,基因结构及重排过程,胚系,可变区,恒定区,胚系,D-J,重排,V-D-J,重排,转录与拼接,各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性,IGH,IGK,IGL,TCRA,TCRB,TCRG,TCRD,V,66,43,38,46,47,6,8,D,27,76,56,54,67,9,8,J,6,5,5,61,13,5,4,淋巴细胞发育过程中基因重排顺序,IG: H,重排,: IgH/,缺失,：,IgH/,TCR:,：,TCR,：,TCR ,淋巴瘤中基因重排形式,克隆性重排,不同的淋巴细胞,相同的重排形式,淋巴细胞单克隆性增生,淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标,克隆性重排的检测方法,Southern,杂交,PCR,法,特异性探针： 胚系的特征性片段外,另一不同大小的片段,Southern,杂交,优点： 敏感性较高,可靠性高,缺点：,DNA,量多（,10ug),新鲜组织,操作复杂,时间长、成本高,放射性同位素,逐渐被,PCR,方法替代,PCR,法,原理,:,VDJ,重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增出重排片段,新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本，,不受,DNA,片段的影响，仅需要少量的,DNA,，,时间短，敏感性高，,是目前最常用的克隆性重排的检测方法。,引物的选择原则,引物位置：,PCR,产物长度,10-15bp,引物本身的长度,0.05),表明,TCR,基因重排在,LyP,和,CALCL,的鉴别中无应用价值,。,必须结合临床病史,Ig,和,TCR,基因重排不一定是谱系的标志：,某些,T,、,B,淋巴瘤有基因重排的交叉,T,B,之间：不成熟的,T,或,B,相对频繁,TCRab, TCRrd,之间,前,T,细胞性白血病,/,细胞淋巴瘤,几乎所有都存在,TCR,克隆性重排，但大约,20%,同时伴有,IGH,基因重排,前,B,细胞性白血病,/,淋巴瘤，非特殊类型,均有,IGH DJ,区克隆性重排,70%,存在,TCR,， 重排对谱系鉴定无帮助,毛细胞白血病,共同表达多克隆性,IG,亚型，认为存在多点亚型转换阻滞,T,细胞大颗粒淋巴细胞白血病,TCR,，,TCR,克隆性重排，存在,TCR,，,TCR,交叉,NK,细胞慢性淋巴细胞增生异常,没有,IG,和,TCR,克隆性重排,侵袭性,NK,细胞白血病,没有,IG,和,TCR,克隆性重排,结外,NK/T,细胞淋巴瘤，鼻型,大多,IG,及,TCR,无重排，少数因存在反应性细胞毒性,T,细胞导致,TCR,克隆性重排,肝脾,T,细胞淋巴瘤,TCR,克隆性重排,来源的存在等位的,TCR,克隆性重排,来源的一部分存在,TCR,克隆性重排，一部分未产生,TCR,克隆性重排,蕈样霉菌病,部分存在,TCR,克隆性重排,原发性皮肤,CD30+T,细胞淋巴增生性疾病,60%,存在,TCR,克隆性重排，,TCR,克隆性重排与淋巴瘤相关,原发皮肤,T,细胞,TCR,克隆性重排；,TCR,克隆性重排可能存在或缺失，但不表达,血管免疫母细胞性,T,细胞淋巴瘤,75-90%,：,TCR,克隆性重排,25-30%,：,IG,克隆性重排，与,EBV+B,细胞相关,间变大细胞淋巴瘤，,ALK+,90%,存在,TCR,克隆性重排与是否表达,T,细胞抗原无关，,10%,不存在,IG,和,TCR,克隆性重排,间变大细胞淋巴瘤，,ALK-,多数存在,TCR,克隆性重排与是否表达,T,细胞抗原无关,肠病型,T,细胞淋巴瘤（,EATL,）,TCR,，,TCR,克隆性重排在各种形态学亚型均存在,T,细胞幼淋巴细胞白血病,TCR,、,TCR,克隆性重排,少量淋巴细胞,小标本或高负荷,B,细胞淋巴瘤中有少量反应性,T,细胞,EBV,或,CMV,感染,免疫抑制患者,淋巴结或外周血中,TCR,的某些组分重排占优势,重排多样性受限制,可出现寡克隆信号。,假克隆和寡克隆信号表现：弱条带或两条以上条带,辨别方法： 多次重复，大小不同的条带,只有那些可重复的相同大小的条带是可信的单克隆性条带,3.,假克隆和寡克隆,淋巴瘤重排检出率不是,100%,假阴性,原因：,（,1,）早期未完成重排；有些类型淋巴瘤缺乏基因重排,（,2,）引物不全,（,3,）与其他基因重排、突变；,（,4,）体细胞超突变,(eg. MCL vs FL),（,5,）检测敏感性限制,（,6,）所用检测技术分析技术,（,7,）不合适的退火温度,解决办法：多组引物组合，仔细分析,仅用一对引物时,滤泡性淋巴瘤,IG,重链和轻链重排；由于其可变区存在大量的体细胞突变，导致单对引物不易扩增出单克隆产物（,10-40%,）。多重,PCR(BIOMED-2),引物可以检测出,90%,的,IGH(V-D-J),基因重排，用此引物可以检测出,100%IGH(D-J),和轻链基因重排,慢性淋巴细胞性白血病,/,小淋巴细胞性淋巴瘤,40-50%,未突变的病例中存在,IG,基因重排，在未突变的病例,BCR,的意义非常重要，常和自身抗体反应相关,幼,B,淋巴细胞白血病,50%,：,IG,未突变的重链克隆性重排。所有病例具有,VH3,（,68%,）和,VH4,（,32%,）基因家族,MALT,淋巴瘤,IG,重链，轻链重排以及可变区体细胞突变,结内边缘带淋巴瘤,VH3,和,VH4,家族明显突变的,IG,基因克隆性重排,儿童结内边缘带淋巴瘤,IG,基因克隆性重排在区别该病和反应性增生作用大,原发皮肤滤泡中心淋巴瘤,具有体细胞高突变的克隆性,IG,重排，但有些不能被,PCR,检测到,套细胞淋巴瘤,IG,克隆性重排，可变区基因大多未突变，但,15-40%,存在低量的突变。,弥漫性大,B,细胞淋巴瘤非特殊类型,可检测到,IG,重链和轻链的克隆性重排,可变区存在体细胞高突变,富于,T,细胞,/,组织细胞的大,B,细胞淋巴瘤,肿瘤,B,细胞存在,IG,克隆性重排，,IG,存在体细胞突变和生发中心的细胞一致。,5,假阳性：,技术原因；,PCR,法影响因素多，严格分区,各种原因所致的假克隆或寡克隆,产物分析区,空气流向,空气流向,空气流向,空气流向,缓冲间,缓冲间,缓冲间,专用走廊,工作流向,扩增区,标本制备区,试剂准备区,产物分析区,空气流向,空气流向,空气流向,空气流向,缓冲间,缓冲间,缓冲间,专用走廊,工作流向,扩增区,标本制备区,试剂准备区,设计,A,设计,B,专门人员：完善技术和内容,专门空间：防止污染,结果分析：注意可能的陷阱，必要时重复,综合判断：结合形态、免疫表型和病史,谢 谢,!,