第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术,佛山科学技术学院,李海燕,本章内容,第一节 提取的方法与技术,第二节 分离精制和鉴定的方法与技术,3,27,第一节,提取的方法与技术,章目录,一、溶剂提取法,1.,概念,溶剂提取法是指根据天然药物中各种化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当的方法将所需化学成分尽可能完全地从药材组织中溶解提出的方法。,章目录,一、溶剂提取法,2,基本原理,溶剂提取法是在渗透、扩散作用下，溶剂渗入药材组织细胞内部，溶解可溶性物质，造成细胞内外溶质的浓度差，从而带动溶质作不断往返的运动，直至细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达到平衡，提出所需化学成分。,章目录,选择合适的溶剂是溶剂提取法的关键。,常用溶剂的极性大小顺序排列如下：,石油醚 苯 无水乙醚 三氯甲烷 乙酸乙酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇 水,亲脂性有机溶剂,亲水性有机溶剂,良好溶剂的选择应遵循,“,相似相溶,”,的规律，根据溶剂的极性，被提取成分及共存的其他成分的性质来决定，同时兼顾考虑溶剂是否使用安全、易得、价廉、浓缩方便等问题。,一、溶剂提取法,章目录,方法与技术,（一）浸渍法,（二）渗漉法,（三）煎煮法,（四）回流提取,法,（五）连续回流提取法,（六）超声提取法,一、溶剂提取法,章目录,（一）浸渍法,是将药材用适当的溶剂在常温或温热的条件下浸泡一定时间，浸出有效成分的一种方法。,操作技术：,一、溶剂提取法,冷浸法,温浸法,章目录,（二）渗漉法,是将药材粗粉置渗漉装置中，连续添加溶剂使渗过药粉，自上而下流动，浸出有效成分的一种动态浸提方法。,操作技术：,粉碎 浸润 装筒 排气 浸渍 渗漉 收集渗漉液,一、溶剂提取法,章目录,（三）煎煮法,是将药材加水加热煮沸，滤过去渣后取煎煮液的一种传统提取方法。,操作技术：,取药材饮片或粗粉，置适当煎器（勿使用铁器）中，加水浸没药材，加热煮沸，保持微沸，煎煮一定时间后，分离煎煮液，药渣可继续依法煎煮数次，合并各次煎煮液，浓缩即得。,一、溶剂提取法,章目录,（四）回流提取法,使用低沸点有机溶剂如乙醇、三氯甲烷等加热提取天然药物中有效成分时，为减少溶剂的挥发损失，保持溶剂与药材持久的接触，通过加热浸出液，使溶剂受热蒸发，经冷凝后变为液体流回浸出器，如此反复至浸出完全的一种热提取方法。,一、溶剂提取法,章目录,（四）回流提取法,操作技术：,将药材粗粉装入圆底烧瓶内，添加溶剂至盖过药面（一般至烧瓶容积,1/2,2/3,处），接上冷凝管，通入冷却水，于水浴中加热回流一定时间，滤出提取液，药渣再添加新溶剂回流,2,3,次，合并滤液，回收有机溶剂后得浓缩提取液。,一、溶剂提取法,章目录,（五）连续回流提取法,是在回流提取法的基础上改进的，能用少量溶剂进行连续循环回流提取，充分将有效成分浸出完全的方法。,一、溶剂提取法,章目录,操作技术,先在圆底烧瓶内放入几粒沸石，然后将装好药材粉末的滤纸袋或筒放入提取器中，药粉高度应低于虹吸管顶部，自冷凝管加溶剂入烧瓶内，水浴加热。至有效成分充分被浸出，提取液回收有机溶剂即得。,（五）连续回流提取法,一、溶剂提取法,章目录,（六）超声提取法,是一种利用超声波浸提有效成分的方法。,其基本原理是利用超声波的空化作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂易于渗入细胞内，同时超声波的强烈振动能传递巨大能量给浸提的药材和溶剂，使它们作高速运动，加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，加速有效成分的浸出，极大地提高提取效率。,一、溶剂提取法,章目录,（六）超声提取法,操作技术：,将药材粉末置适宜容器内，加入定量溶剂，密闭后置超声提取器内，选择适当超声频率提取一段时间（一般只需要数十分钟）后即得。,一、溶剂提取法,章目录,二、其他提取方法,（一）水蒸气蒸馏法,是一种利用某些挥发性成分与水或水蒸气共同加热，能随水蒸气一并蒸馏出，经冷凝后分取获得的性质，使之从天然药物中提出的方法。,章目录,（一）水蒸气蒸馏法,操作技术：,将药材粗粉装入蒸馏瓶内，加入水使药材充分浸润，体积不超过蒸馏瓶容积的,1/3,，然后加热水蒸气发生器使水沸腾，产生水蒸气通入蒸馏瓶，药材中挥发性成分随水蒸气蒸馏被带出，经冷凝后，收集于接受瓶中，若馏出液由浑浊变澄清透明，表示蒸馏基本完成。,二、其他提取方法,章目录,（二）升华法,是利用某些固体物质具有在低于其熔点的温度下受热后，不经熔融就直接转化为蒸气，遇冷后又凝固为原来的固体的性质，使之从天然药物中提出的方法。,二、其他提取方法,章目录,（二）升华法,操作技术：,预先粉碎待升华的天然药物，将粉末置于升华器皿中，铺均匀，上面放一冷凝器，加热升华器皿到一定温度，使被提取物质升华，升华物质冷凝于冷凝器表面即得。,二、其他提取方法,章目录,（三）超临界流体萃取技术,超临界流体萃取（,supercritical fluid extraction,，,SFE,）是一种利用某物质在超临界区域形成的流体，对天然药物中有效成分进行萃取分离的新型技术，集提取和分离于一体。,二、其他提取方法,章目录,（三）超临界流体萃取技术,操作技术：,超临界流体萃取工艺程序：将药材原料投入萃取器,6,中，对萃取器,6,和分离器,7,分别进行加热或冷却，当达到所选定的温度时，开启,CO,2,气瓶阀门及阀门,12,进气，启动高压阀,4,对系统加压，当达到预定压力时，调节减压阀,9,，使分离器,7,内压力达到设定值，打开放空阀,10,调节流量。通过各阀门的调节，使萃取过程中通过的流量及萃取器内压力、分离器内压力都稳定在设定的操作条件后，关闭阀门,10,，打开阀门,11,，开始进行循环萃取，萃取过程中达到一定时间后，从阀门,8,取出萃取物。,二、其他提取方法,章目录,（三）超临界流体萃取技术,超临界流体萃取工艺程序：,1 CO,2,气瓶,2,纯化器,3,冷凝器,4,高压泵,5,加热器,6,萃取器,7,分离器,8,放油器,9,减压阀,10.11.12,阀门,二、其他提取方法,章目录,课堂活动,如何根据实际工作的需要选择适当的提取方法？试用连线一一对应连接。并叙述各法选用的仪器、操作步骤、注意事项和适用范围。,章目录,浸渍法 提取受热易破坏的成分，能保持良好浓度,差的一种动态浸提方法,渗漉法 以水为溶剂加热提取,煎煮法 使用索氏提取器进行提取,回流提取法 提取受热易破坏的成分及含多糖物质较多,的天然药物,连续回流提取法 用有机溶剂自天然药物中提取脂溶性成分,水蒸气蒸馏法 提取有升华性的成分,升华法 提取能随水蒸气蒸馏且不溶于水的成分,课堂活动,章目录,点滴积累,1.,天然药物化学成分的提取方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法、超临界流体萃取技术等。溶剂提取法是目前提取有效成分最常用的方法，具体的操作技术有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法、超声提取法等。,2.,研究天然药物化学成分需首先从提取工作开始。对各种方法所用的溶剂种类、仪器、特点及适用范围进行比较区别，合理设计提取方法和正确的提取操作将为下一步分离工作的顺利进行打下坚实的基础。,章目录,第二节,分离精制和鉴定的方法与技术,章目录,一、系统溶剂分离法,是一种按极性由小到大的顺序选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次提取分离提取液中各种不同成分，使各溶解度有差异的成分得到分离的方法。,此法是早年研究天然产物有效成分的一种最主要的方法，目前仍是研究不明成分最为常用的方法。,章目录,操作技术：,适当浓缩总提取液，或拌入适量惰性吸附剂如：粗硅胶、纤维粉及硅藻土等，低温或自然干燥后粉碎，然后依次用石油醚（或苯）、乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水分步进行抽提，使溶解度不同的各种成分得到分段分离。也可以选择其中三、四种不同极性的溶剂组成溶剂系统，如石油醚苯乙醚三氯甲烷乙酸乙酯正丁醇或戊醇，由低极性到高极性分步进行抽提，分成若干部位。,一、系统溶剂分离法,章目录,生物碱,强心苷,黄酮类,皂苷,生物碱盐等,挥发油,蛋白质等,石油醚、苯,乙醚、三氯甲烷,三氯甲烷,-,乙醇,乙酸乙酯,正丁醇,甲醇、乙醇、丙酮,水,一、系统溶剂分离法,章目录,二、两相溶剂萃取法,是指往提取液中加入一种与其互不相溶的溶剂配成两相溶剂系统，利用混合物中各种成分分配系数的差异而将所需成分萃取出来的分离方法。,章目录,基本原理：利用混合物中各种成分在两相互不相溶的溶剂中,分配系数,的差异而达到分离的目的。混合物中各种成分在同一两相溶剂系统中分别有各自不同的分配系数，若,各种成分的分配系数差异越大，则分离效果越好。,K,=,C,u,/,C,L,K,表示分配系数,；,C,u,表示溶质在上相溶剂中的浓度；,C,L,表示溶质在下相溶剂中的浓度。,二、两相溶剂萃取法,章目录,（一）简单萃取法,二、两相溶剂萃取法,待萃取物和溶剂装入分液漏斗,振摇，重复数次,静置，使两液分层,开启活塞使下层液放出,从分液漏斗的上端倒出上层液,操作技术：,这是一种常用的简便萃取技术，小量萃取一般在分液漏斗中进行。,章目录,（二）逆流连续萃取法,是利用两相互不相溶的溶剂相对密度的不同，使相对密度小的相液作为移动相（或分散相），逆流连续穿过相对密度大的作为固定相（或连续相）的相液，借以交换溶质而达到分离的一种连续萃取技术。,二、两相溶剂萃取法,章目录,（三）逆流分溶法,逆流分溶法（,counter current distribution,，,CCD,）是一种高效、多次、连续的两相溶剂萃取分离方法，亦称为逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。,二、两相溶剂萃取法,章目录,（四）液滴逆流分配法,液滴逆流分配法,（,droplet counter current chromatography,，,DCCC,），,利用混合物中各成分在两液相间的分配系数的差异，使移动相形成液滴，通过作为固定相的液柱实现逆流分配，从而达到分离目的。,二、两相溶剂萃取法,章目录,三、沉淀法,是指在天然药物的提取液中加入某些试剂,使产生成沉淀或降低溶解性而从溶液中析出，从而获得有效成分或去除杂质的方法。,章目录,（一）酸碱沉淀法,是一种利用某些成分能在酸（或碱）中溶解，继而又在碱（或酸）中生成沉淀的性质达到分离的方法。,操作技术：,往提取液中加入适量酸水（或碱水），将欲分离成分处理成盐溶解于酸水（或碱水）中，然后再加入适量碱水（或酸水），使欲分离成分恢复原来的结构，形成沉淀析出，最后可以离心或利用与水不相混溶的有机溶剂把这些化学成分萃取分离获得。,三、沉淀法,章目录,（二）试剂沉淀法,是一种利用一些成分能与某些试剂产生沉淀的性质，或利用某些成分在不同溶剂中溶解度的差异，通过加入特定试剂或溶剂，使生成沉淀，与其他成分分离的方法。,操作技术：,向提取液中加入某些特定试剂或溶剂，使欲分离成分与试剂生成沉淀或因溶解度降低而沉淀析出，待完全沉淀后，滤过即得。,三、沉淀法,章目录,四、结晶与重结晶法,是利用混合物中各种成分在溶剂中溶解度的差别，使所需成分以结晶状态析出，再进一步纯化处理，以达到分离精制目的的分离方法。,章目录,选择合适的溶剂是结晶法的关键。,理想的溶剂必须具备以下条件：,不与结晶物质发生化学反应；,对结晶物质的溶解度随温度不同有显著差异，热时溶解度大，冷时溶解度小；,对可能存在的杂质溶解度非常大或非常小（即冷热均溶或均不溶）；,沸点适中，不宜过高或过低；,能给出较好的结晶。,常用的溶剂有水、乙酸、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等。当不能选择到一种合适的溶剂时，通常选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂。,四、结晶与重结晶法,章目录,操作技术：,四、结晶与重结晶法,制备结晶溶液,趁热滤过，除去不溶性杂质,将滤液放冷，使析出结晶,抽气滤过，将结晶从母液中分出,重结晶,晶体的干燥,章目录,难点释疑,结晶法如何选择合适的混合溶剂？,选用混合溶剂，最好选择结晶成分能在低沸点溶剂中易溶解，而在高沸点溶剂中难溶解的两种混合溶剂，因为低沸点溶剂较易挥发而逐渐减少在混合溶剂中的比例，结晶即可慢慢析出。,章目录,五、透析法,是利用透析膜具有选择性透过的特点，使提取液中小分子物质可通过透析膜，而大分子物质不能通过，则分子量差异较大的物质获得分离的方法。,章目录,操作技术：,如图所示，将提取液置透析膜中，扎紧口，外面护以尼龙网袋，放入清水缸中。不断更换缸内的水，使膜内外的浓度差增加，或稍加搅拌或适当加温处理；也可以在近透析膜两旁处放置两个电极，称电透析，通电后使带电荷离子的透析速度增加,10,倍以上，以加快透析的速度。透析过程中，用定性反应对膜内药液有效成分或指标成分进行检查分析，判断透析是否完全。,五、透析法,章目录,六、分馏法,是利用各沸点不同的化合物组成的混合物，在分馏过程中产生高低不同的蒸气压，从而收集到不同沸点温度的馏分，达到分离目的的方法。,章目录,操作技术：,实验室常用简单分馏装置如图所示，操作时将待分馏的试样放入圆底烧瓶中，加入沸石，安装好装置后，在分馏柱的外围尽量用石棉绳包住，选择合适的热浴加热。当瓶内液体一开始沸腾时，就要注意调节温度，使蒸气缓慢升入分馏柱。当蒸气进入分流柱时，由于柱外空气的冷却，部分蒸气凝成液体，显然高沸点的组分较易被冷凝，随着分流柱管的升高，愈向上混合蒸气中所含高沸点的组分愈少，到了一定高度时可获得某一纯的组分。待低沸点组分蒸完后，再逐渐升温，如此进行操作，使不同沸点的组分逐一分馏出来。,六、分馏法,章目录,课堂活动,天然药物提取液为混合物，根据成分性质的不同，请用连线选择相适应的分离方法。,系统溶剂萃取法 从某天然药物的水提液中加入戊醇获取皂苷,两相溶剂萃取法 分离未知成分的天然药物提取液,沉淀法 去除盐酸小檗碱粗制品中的杂质（已知盐酸小檗碱热水,易溶，冷水难溶）,结晶法 加入雷氏铵盐从某天然药物水提液中获得季铵盐,透析法 毒芹总碱中的毒芹碱（沸点,166,167,）和羟基毒芹碱,（沸点,226,）,分馏法 分离某天然药物蛋白质提取液中的无机盐和其他小分子,杂质,章目录,七、色谱法,色谱法（,chromatography,），又称为色谱分离法、层析法，是一种分离、纯化和鉴定化合物的物理化学分离分析方法。,基本原理,:,是利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的差异而达到分离。,章目录,色谱法的分类,依据,分类,按固定相或支持剂种类不同,氧化铝色谱、硅胶色谱、聚酰胺色谱、凝胶 色谱等,按移动相种类不同,气相色谱、液相色谱,按色谱原理不同,吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱等,按操作方式不同,柱色谱、纸色谱、薄层色谱等,七、色谱法,章目录,被分离化合物与相应选择的色谱方法,被分离化合物,可选用色谱,生物碱类,一般生物碱,硅胶、氧化铝柱色谱,极性较大的生物碱,分配色谱,季铵型水溶性生物碱,分配色谱、离子交换色谱,皂苷类、强心苷类,分配色谱、硅胶吸附色谱,挥发油、甾体、萜类,硅胶、氧化铝色谱,黄酮类、鞣,质,聚酰胺吸附色谱,有机酸、氨基酸,离子交换色谱、分配色谱、活性炭吸附色谱,蛋白质、多肽、多糖类,凝胶滤过色谱,七、色谱法,章目录,（一）柱色谱法,是一种将分离材料装入柱状容器中，以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的色谱分离方法，也是色谱法最早出现的形式，可用于分离天然药物中各种化学成分。,1,吸附柱色谱法,是一种在柱状容器中操作，利用作为固定相的吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。,七、色谱法,章目录,1,吸附柱色谱法,（,1,）基本原理：,当混合物成分到达作为固定相的吸附剂表面时，由于吸附剂表面与成分分子的吸附作用，产生了成分分子在吸附剂表面浓度增大的吸附现象；当移动相连续通过吸附剂表面时，由于移动相与混合物成分争夺吸附剂活性表面，产生了成分分子溶解于移动相的解吸附现象；随着移动相的移动，混合物在不断进行着吸附,-,解吸附的可逆过程，利用各成分在两相中迁移速度的不同而达到分离。,七、色谱法,章目录,1,吸附柱色谱法,（,2,）,常用的吸附剂：吸附剂有氧化铝、硅胶、硅藻土、氧化镁、碳酸钙、聚酰胺和活性炭等，常用的有以下几种：,1,）硅胶,2,）氧化铝,3,）聚酰胺,4,）活性炭,七、色谱法,章目录,1,）硅胶,硅胶是一种微呈酸性的多孔性物质。常用,SiO,2,xH,2,O,表示，为硅氧烷交链结构：,其骨架表面具有很多硅醇基，使硅胶能与许多化合物形成氢键而产生吸附作用。游离硅醇基数目的多少决定了硅胶吸附作用的强弱。硅醇基也容易通过氢键与水结合，随着含水量的增加，硅胶表面的游离硅醇基数目减少，硅胶吸附其他化合物的能力便随之减弱。,七、色谱法,章目录,2,）氧化铝,氧化铝是一种吸附力很强的亲水性吸附剂，有酸性、碱性、中性三种规格。其吸附活性也与含水量有关，随着含水量的增加，吸附能力减弱。,七、色谱法,章目录,硅胶、氧化铝活度与含水量关系,活度等级,含水量,%,硅胶,氧化铝,0,0,5,3,15,6,25,10,38,15,七、色谱法,章目录,3,）聚酰胺,聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物。商品名又称为绵纶、尼龙。色谱分离常用聚己内酰胺（绵纶,6,）和聚己二酰己二胺（绵纶,66,），其中聚己内酰胺可用结构式表示为：,七、色谱法,章目录,3,）聚酰胺,移动相,聚酰胺吸附色谱的原理,固定相,七、色谱法,章目录,3,）聚酰胺,聚酰胺对化合物吸附力的强弱取决于形成氢键的能力，形成氢键的能力受以下因素影响：,溶剂的种类：聚酰胺形成氢键的能力在水中最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。若应用各种溶剂在聚酰胺柱色谱中作为洗脱剂，则洗脱能力的顺序如下：水甲醇或乙醇丙酮稀氢氧化钠液或稀氨溶液甲酰胺或二甲基甲酰胺尿素水溶液。,化合物分子结构：在含水溶剂中，化合物分子结构对氢键缔合的影响有以下几点规律：,七、色谱法,章目录,3,）聚酰胺,A.,化合物分子中能形成氢键的基团数目越多，被聚酰胺吸附越强。如：,七、色谱法,章目录,3,）聚酰胺,B.,形成氢键的基团所处位置不同，被吸附的强度也不同。如：,C.,分子中芳香核、共轭双键多者被吸附强度大，少者则被吸附强度小。 如：,七、色谱法,章目录,3,）聚酰胺,D.,能形成分子内氢键者被吸附强度减小。 如：,七、色谱法,章目录,4,）活性炭,活性炭是一种非极性吸附剂，具有较强的吸附能力， 其吸附能力受溶剂的影响，在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中吸附力较弱。在一定条件下，对不同物质的吸附力也有差别。一般对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。,七、色谱法,章目录,1,吸附柱色谱法,（,3,）,移动相：用吸附柱色谱法分离混合物，选择何种溶剂为移动相对分离效果有极大的影响。所选移动相溶剂应具备纯度高，不含水分；与试样、吸附剂不起化学反应；对被分离成分有适当的溶解度；黏度小；易挥散等条件。对于极性吸附剂，若选择的移动相溶剂极性越大，则其展开或洗脱能力就越强；对于非极性吸附剂，则刚好相反，选择的移动相溶剂极性越小，其展开或洗脱能力就越强。具体选择时，尚需结合被分离物质的极性来综合考虑。,七、色谱法,章目录,1,吸附柱色谱法,（,4,）,被分离物质：被分离成分、吸附剂、移动相三者为组成吸附柱色谱必不可少的要素，被分离成分的结构和极性大小决定了其与吸附剂、移动相之间的相互作用。对于极性吸附剂，被分离物质的极性越大，被吸附越强，移动相进行洗脱就越困难。化合物的极性与其官能团的种类、数目及位置有关，同时也应注意考虑分子中电效应、立体效应等因素的影响。,七、色谱法,章目录,1,吸附柱色谱法,（,4,）,被分离物质：,常见一些化合物官能团的极性大小顺序如下：,七、色谱法,章目录,1,吸附柱色谱法,被分离成分、吸附剂、移动相三者关系密不可分，一般而言，极性吸附剂如硅胶、氧化铝等适用于分离亲脂性成分，非极性吸附剂如活性炭适用于分离亲水性成分。若被分离物质的极性较大，可选用活度较低的吸附剂，而移动相的极性较大；若被分离物质的极性较小，可选用活度较高的吸附剂，而移动相的极性较小。具体应用时，需全面考虑吸附剂、移动相及被分离成分三者间相互联系又相互制约的关系，选择合适的条件，使达到分离的目的。,七、色谱法,章目录,1,吸附柱色谱法,（,5,）操作技术,：,选择色谱柱,装柱,上样,洗脱,收集洗脱液,七、色谱法,章目录,课堂活动,模拟实验室硅胶柱色谱操作，取一色谱柱和适量硅胶，学生练习湿法装柱，叙述操作步骤及操作过程中的注意事项；教师针对岗位工作，讲解实际应用。,章目录,2,分配柱色谱法,是一种在柱状容器中操作，利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的不同，来达到分离的色谱分离方法。,（,1,）基本原理：分配柱色谱的基本原理与两相逆流萃取法相同。两相溶剂中的一相需作为固定相，常以某种惰性固体吸住该相溶剂，使之固定，这种吸着了固定相溶剂的固体物质称为支持剂（也称载体或担体）；另一相溶剂则作为移动相。进行分离时，将被分离的混合物配成试样溶液加到固定相上，通过移动相的流动，使试样中各成分在两相之间的分配不同而获得分离。,七、色谱法,章目录,2,分配柱色谱法,分配柱色谱根据固定相与移动相的极性不同又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。以极性大的溶剂（如水或亲水性溶剂）为固定相，极性小的溶剂为移动相的分配色谱称为正相分配色谱，固定相常用水或缓冲液，移动相则采用三氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂。而以极性小的溶剂（如三氯甲烷、石油醚等亲脂性有机溶剂）为固定相，移动相溶剂却极性较大的分配色谱则称为反相分配色谱，固定相可选用石蜡油，移动相可选择水或甲醇。,七、色谱法,章目录,2,分配柱色谱法,（,2,）支持剂：在分配柱色谱中，作为支持剂的固体物质要求其本身无吸附作用，不溶于两相溶剂中，不与被分离物质发生化学反应，但能吸着一定量的固定相，且移动相能自由通过却不改变其组成。常用的有吸水硅胶、硅藻土、纤维素粉和滤纸等。,七、色谱法,章目录,2,分配柱色谱法,（,3,）溶剂系统：分配色谱中的固定相和移动相是由二元或三元甚至三元以上溶剂按一定比例组成的复合两相溶剂系统。选择适当的溶剂系统，可提高分离的效率。常用纸色谱摸索具体的分离条件，寻找合适的溶剂系统。,（,4,）被分离物质：一般在正相分配色谱中，因移动相极性较固定相极性小，故被分离物质中极性较小的成分随移动相迁移速度较快；反之，在反相分配色谱中，被分离物质中极性较大的成分随移动相迁移速度较快。,七、色谱法,章目录,难点释疑,如何正确理解分配柱色谱法中固定相、移动相与被分离物质三者间的关系？,对于正相分配色谱，常选用极性大的溶剂（如水、缓冲溶液或亲水性溶剂等）为固定相，极性小的溶剂（如三氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇等）为移动相，用于极性较大的化合物如生物碱、苷类、酚性物质、有机酸和糖类等的分离，被分离物质中极性较小的成分随移动相迁移速度较快；对于反相分配色谱，常选用极性小的溶剂（如三氯甲烷、石油醚等亲脂性有机溶剂等）为固定相，极性大的溶剂（如水或甲醇等）为移动相，用于极性较小的化合物的分离，被分离物质中极性较大的成分随移动相迁移速度较快。,章目录,3.,离子交换柱色谱法,是一种利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质，以离子交换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非离子型物质、或具有不同解离度的离子化合物得到分离的一种色谱方法。,七、色谱法,章目录,3.,离子交换柱色谱法,（,1,）基本原理：离子交换树脂是一类含有解离性功能基团的特殊高分子化合物，一般呈球状或无定形粒状。根据其所含解离性功能基团的不同，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类；在水溶液中，前者能通过,SO,3,H,、,COOH,或酚羟基中解离的,H,与溶液中的阳离子进行可逆性交换，后者能通过伯、仲、叔、季铵基中解离的,OH,与溶液中的阴离子进行可逆性交换。而其本身却不溶于水、酸、碱和有机溶剂。若以,R,代表离子交换树脂的母体，则其色谱分离的基本原理可表示为：,阳离子交换树脂,RSO,3,H,+,+,Na,+,Cl RSO,3,Na,+,+,H,+,Cl,阴离子交换树脂,RN,+,OH,+ Na,+,Cl,RN,+,Cl,+ Na,+,OH,七、色谱法,章目录,3.,离子交换柱色谱法,（,2,）离子交换树脂的选择：具体选择离子交换树脂时，应综合考虑被分离物质所带电荷种类及其解离能力强弱、分子的大小与数量。,（,3,）操作技术：,树脂的预处理 装柱 上样 洗脱 再生,七、色谱法,章目录,4.,凝胶滤过柱色谱法,凝胶滤过柱色谱法又称为凝胶渗透柱色谱法、分子筛滤过柱色谱法及排阻柱色谱法等，是以凝胶作为固定相，选择适当的溶剂进行洗脱，使混合物中分子量大小不同的化合物得到分离的方法。,七、色谱法,章目录,4.,凝胶滤过柱色谱法,（,1,）基本原理：凝胶是具有多孔性网状结构的高分子化合物。由于受凝胶颗粒中网孔半径的限制，被分离试样中比网孔小的化合物可自由进入凝胶颗粒内部；而比网孔大的化合物不能进入凝胶颗粒内部被排阻，只能通过凝胶颗粒外部的间隙。随着移动相的流动，被分离试样中各成分的移动速率不同，大分子化合物阻力较小，流速较快，先被洗脱；而小分子化合物阻力较大，滞留在凝胶颗粒内部时间长，流速较慢，则后被洗脱，使试样中大小分子化合物获得分离。,七、色谱法,章目录,4.,凝胶滤过柱色谱法,七、色谱法,凝胶色谱法分离机理示意图,凝胶颗粒,小分子物质,大分子物质,章目录,4.,凝胶滤过柱色谱法,（,2,）凝胶的种类及性能：,选择合适的凝胶，是凝胶色谱法分离的关键。,商品凝胶的种类很多，常用的有：,1,）葡聚糖凝胶：,又称为交联葡聚糖，是由葡聚糖和甘油通过醚桥（,OCH,2,CHOHCH,2,O,）相交链而成的多孔性网状结构物质。具有亲水性，但不溶于水、稀酸、碱和盐溶液，能在水中溶胀成胶粒，在,pH3,10,内稳定，适用于分离水溶性成分如蛋白质、肽、氨基酸、糖及苷类等，应用最为广泛。,七、色谱法,章目录,交联葡聚糖的化学结构,七、色谱法,章目录,2,）葡聚糖凝胶（,sephadex,）,LH-20,：葡聚糖凝胶,LH-20,分子中引入了亲脂性基团，除了能在水中溶胀外，也能在许多有机溶剂如醇、甲酰胺、丙酮、三氯甲烷等溶剂中溶胀（在乙酸乙酯、甲苯中溶胀不多），并在,pH,2,的无氧化剂溶液中呈稳定状态。增大了应用范围，不仅可用于分离水溶性化合物，还可用于分离一些难溶于水或具一定程度亲脂性的化合物，如黄酮、蒽醌、香豆素等。,此外，还有聚丙烯酰胺凝胶（在,pH2,10,内稳定，使用情况与葡聚糖凝胶相似），琼脂糖凝胶（适合于分离分子量在百万以上的特大分子化合物），以及结合了不同离子交换基团的葡聚糖凝胶衍生物等。,七、色谱法,章目录,4.,凝胶滤过柱色谱法,（,3,）操作技术,1,）凝胶的选择,2,）凝胶的浸泡溶胀,3,）装柱,4,）加样,5,）洗脱,6,）再生,七、色谱法,章目录,5.,大孔吸附柱色谱法,是一种利用大孔吸附树脂具有的吸附性能及分子筛作用，使分子量的大小及吸附力的强弱不同的混合物中各成分获得分离的方法。,（,1,）基本原理：大孔吸附树脂是一种化学结构与离子交换树脂类似却不含交换基团，具有大孔结构的有机高聚物吸附剂。一方面，大孔吸附树脂通过范德华引力或形成氢键等分子间力吸附有机化合物；另一方面，其本身的多孔性网状结构决定了具有筛选性分离的特点。由于大孔吸附树脂具有吸附性能及分子筛作用的特点，故欲分离的各天然药物化学成分根据其分子量的大小及吸附力的强弱，在选定的大孔吸附树脂上经适宜的溶剂洗脱而获得分离。,七、色谱法,章目录,5.,大孔吸附柱色谱法,（,2,）大孔吸附树脂的类型及性能：大孔吸附树脂多为白色球形颗粒，粒度通常为,20,60,目，根据聚合材料的不同，可分为非极性、中极性和极性三大类型。大孔吸附树脂的理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物有较好的选择性，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响。,（,3,）影响分离的因素,1,）树脂本身的化学结构,2,）被分离成分的性质,3,）溶剂的影响,七、色谱法,章目录,课堂活动,根据不同性质的化学成分，请用连线选择与其相适应的色谱分离方法。,氧化铝吸附柱色谱法 分子量大小不同的化合物的分离,凝胶滤过柱色谱法 碱性亲脂性化合物的分离,聚酰胺吸附柱色谱法 黄酮类化合物的分离,离子交换色谱法 酸性亲脂性化合物的分离,硅胶吸附柱色谱法 离子性化合物的分离,章目录,（二）薄层色谱法,薄层色谱法（,thin layer chromatography,，,TLC,）是一种在平面载板上均匀涂布适宜的固定相形成一薄层，将欲分离的试样于薄层板上点样，随着移动相溶剂的移行展开，混合物中各成分获得分离的方法。,（,1,）基本原理：与柱色谱法的原理基本一致，常见吸附薄层色谱和分配薄层色谱两种。,七、色谱法,章目录,（二）薄层色谱法,（,2,）常用吸附剂和支持剂：吸附薄层色谱常用的吸附剂为氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺、纤维素等。,（,3,）展开剂的选择：展开剂的选择可根据被分离物质的溶解性、酸碱性、极性等性质及溶剂的极性，结合考虑所选吸附剂的吸附性能，选择单一溶剂或混合溶剂。,（,4,）显色的方法：常用紫外线照射法、喷雾显色法和碘蒸气显色法三种。,七、色谱法,章目录,（二）薄层色谱法,（,5,）操作技术：,1,）制板,2,）薄层板的活化,3,）点样,4,）展开,5,）显色,6,）计算比移值,原点至色谱斑点中心的距离,原点至溶剂前沿的距离,R,f,值,七、色谱法,章目录,（二）薄层色谱法,（,9,）制备性薄层色谱：当需要分离微量混合物或天然化合物的降解产物时，则选择制备性薄层色谱。经制备性薄层色谱分离，可获得毫克量的纯品。,七、色谱法,章目录,课堂活动,制备硅胶,G-CMC-Na,板：称取,8g,硅胶,G,，加,24ml,浓度,0.5,CMC-Na,水溶液，在乳钵中研磨均匀后，倒在一定大小的玻璃载板上，均匀涂铺，厚度约,0.250.5mm,，手轻轻振动玻璃板至表面均匀平整，室温放置晾干，用前活化。请学生回答下列问题：,（,1,）如何进行活化？,（,2,）应用此硅胶板进行某混合物的分离，还有哪些操作步骤？,（,3,）如何计算斑点的,Rf,值？,章目录,（三）纸色谱法,纸色谱是以滤纸为支持剂，滤纸上吸着的水（或根据实际分离的需要，经适当处理后滤纸上吸附的溶液）为固定相，用一定的溶剂系统为移动相进行展开，利用混合物中各成分分配系数的差异而达到分离的一种分配色谱法。,七、色谱法,章目录,（四）高效液相色谱法,高效液相色谱法,（,heigh performance liquid chromatography,，,HPLC,）,也称高压液相色谱法、高速液相色谱法，是在经典液相色谱（柱色谱）的基础上发展而成的一种高效、快速、高灵敏的色谱分离方法。,七、色谱法,章目录,（四）高效液相色谱法,（,1,）基本原理：根据被分离物质中各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子量大小的差异而获得分离。可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱及凝胶滤过色谱等四类 。,七、色谱法,章目录,七、色谱法,高效液相色谱装置的模式图,溶剂贮瓶,加压泵,压力表,压力表,过滤器,阻尼器,进样装置,色谱柱,检测器,收集器,记录仪,章目录,实例分析,实例：,丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参,(,Salvia miltiorrhiza,Bge.),的干燥根及根茎，常用作治疗冠心病心绞痛的中成药制剂如复方丹参片等的原料药材。应用高效液相色谱法可同时分离测定复方丹参片中四种具有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等作用的脂溶性活性成分丹参酮类（菲醌化合物）的含量：二氢丹参酮,I,（,dihydrotanshinone I,）、丹参酮,I,（,tanshinone I,）、隐丹参酮（,cryptotanshinone,）、丹参酮,A,（,tanshinoneA,）。结果见图,2-20,，试分析色谱图中,1,4,为何种成分？,章目录,图,2-20,复方丹参片中,4,种丹参酮类化合物的分离,色谱条件：,Agilent Eclipse Plus C18,柱（,5m,，,250mm4.6mm,）；流动相：甲醇,-,水（,73:27,）；流速：,1.000mL/min,；检测波长：,270nm,。,章目录,丹参酮,I,二氢丹参酮,I,丹参酮,A,隐丹参酮,分析：,根据化合物结构判断四种丹参酮类成分的极性大小顺序为：二氢丹参酮,I,丹参酮,I,隐丹参酮丹参酮,A,。因为色谱移动相选用了极性大的甲醇,-,水，所以二氢丹参酮,I,极性大而最先被洗脱，丹参酮,A,极性小而最后被洗脱。结果为：,1,是二氢丹参酮,I,，,2,是丹参酮,I,，,3,是隐丹参酮，,4,是丹参酮,A,。,章,目录,（五）气相色谱法,气相色谱法,（,gas chromatography,，,GC,）是,一种以气体作为流动相的色谱分离方法。根据固定相的不同，可分为气固吸附色谱及气,-,液分配色谱两类。其中，以气,-,液分配色谱的应用最为普遍。,（,1,）基本原理：利用混合物中各组分在气体与固定相之间吸附能力的不同或分配系数的差异而获得分离。,七、色谱法,章目录,点滴积累,1.,天然药物化学成分的分离方法和技术种类虽然繁多，但是各自的基本原理却差异较大。准确理解各种分离方法的原理，有助于根据实际工作需要灵活选用。,2.,使用系统溶剂分离法、两相溶剂萃取法、沉淀法、透析法和分馏法往往能够除去大量杂质却难以获得单体化合物，若能再结合结晶法和色谱法，可以获得很好的分离效果。,3,色谱法的学习注意明确区分各种色谱技术的固定相、移动相及适用范围。,章目录,