如何测定食品中的维生素

*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,概述,维生素是维持机体正常生理功能及细胞内特异代谢反应所必需的一类微量低分子天然有机化合物。,yyy,9/23/2024,1,二、类别,9/23/2024,2,三、分类,根据维生索的溶解性可将其分成两大类：,1,脂溶性维生素 包括维生素,A,、,D,、,E,、,K,，它们不溶于水而溶于脂肪及有机溶剂,(,如苯、乙醚及氯仿等,),中；在食物中它们常与脂类共存，在酸败的脂肪中容易破坏；其吸收与肠道中的脂类密切相关，主要储存干肝脏中；,2,水溶性维生素 包括,B,族维生素（维生素,B1,、,B2,、,PP,、,B6,、叶酸、,B12,，泛酸、生物素等）和维生素,C,。与脂溶性维生素不同，水溶性维生素及其代谢产物较易排出，体内没有非功能性的单纯的储存形式。,有些化合物，其活性类似维生素，曾被列入维生素类，通常称之为“类维生素”，如生物类黄酮、辅酶,Q,、肌醇、硫辛酸、对氨基苯甲酸、乳清酸和牛磺酸等。,9/23/2024,3,四、测定意义,食品科学研究者需要准确的食品成分分析信息，计算营养素的膳食摄入，以改善人类的营养；,食品营养价值评价；,食品生产工艺设计及强化食品的评价；,五、测定方法,涉及人体和动物的生物分析方法；,利用原生生物、细菌和酵母等的微生物分析方法；,化学法、分光光度法、荧光法、色谱、酶法、免疫和放射等物理化学分析方法。,9/23/2024,4,脂溶性维生素的测定,脂溶性维生素的理化性质：,溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等有机溶剂。,耐酸碱性：,V,A,、,V,D,对酸不稳定，对碱稳定；,V,E,对酸稳定，对碱不稳定。,耐热性：,V,A,、,V,D,、,V,E,耐热性好，能经受煮沸,耐氧化性：,V,A,易被氧化，光、热促进氧化,V,E,易被氧化，光、热、碱促进氧化,V,D,性质稳定，不易氧化,9/23/2024,5,一、维生素,A,的测定,维生素,A,类是指含有,-,白芷酮环的多烯基结构、并具有视黄醇生物活性,的一大类物质。,广义而言包括已经形成的维生素,A,和维生素,A,原,。,动物体内具有视黄醇生物活性功能的维生素,A,类包括视黄醇、视黄醛、视黄酸等物质，,4-,氧视黄酸、,4-,羟视黄酸等不具有视黄醇生物活性功能。,维生素,A,分为维生素,A1,和维生素,A2,，,A1,主要存在于海产鱼中，,A2,主要存在于淡水鱼中。,在植物中不含已形成的维生素,A,，在黄、绿、红色植物中含有类胡萝卜素，其中一部分可在体内转变成维生紊,A,的类胡萝卜素称为维生素,A,原，如,-,胡萝卜素、,-l,胡萝卜素、,-,胡萝卜素等。目前已经发现的类胡萝卜素约,600,种，仅有约,1/10,为维生素,A,原。,9/23/2024,6,维生素,A1(,视黄醇,),维生素,A2,9/23/2024,7,（一）三氯化锑比色法,1,原理,维生素,A,在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，生成蓝色物质，其颜色深浅与溶液中所含维生素,A,的含量成正比。,该蓝色物质不稳定，需在一定时间内（,6,秒）用分光光度计于,620nm,波长处测定其吸光度。,2,试剂,无水乙醚、无水乙醇、三氯甲烷等试剂需预先处理。,维生素,A,标准溶液,3,操作步骤维生素,A,极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。,9/23/2024,8,3.1,样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。,3.1.1,皂化法：适用于维生素,A,含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素,A,损失。,皂化：根据样品中维生素,A,含量的不同，称取,0.5,5g,样品于三角瓶中，加入,10mL 1:1,氢氧化钾及,20,40mL,乙醇，于电热板上回流,30 min,至皂化完全为止。,根据上述性质，测定脂溶性维生素时通常先用皂化法处理样品，水洗去除类脂物。然后用有机溶剂提取脂溶性维生素（不皂化物），浓缩后溶于适当的溶剂中测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂（如焦性没食子酸，抗坏血酸等）。对于某些含脂肪量低、脂溶性维生素含量较高的样品，可以先用有机溶剂抽提，然后皂化，再提取。对于那些对光敏感的维生素，分析操作一般需要在避光条件下进行。,9/23/2024,9,3.2,标准曲线制备,准确取一定量的维生素,A,标准液于,4,5,个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。,取相同数量比色管顺次取,1mL,三氯甲烷和标准系列使用液,1mL,，各管加入乙酸酐,1,滴（可除去微量吸入的水分），制成标准比色系列。,于,620nm,波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入,9mL,三氯化锑三氯甲烷溶液。于,6s,内测定吸光度。,以吸光度为纵坐标，以维生素,A,含量为横坐标绘制标准曲线图。,9/23/2024,10,3.3,样品测定于一比色管中加入,10mL,三氯甲烷，加入,1,滴乙酸酐为空白液。,另一比色管中加入,1mL,三氯甲烷，其余比色管中分别加入,1mL,样品溶液及,1,滴乙酸酐。,其余步骤同标准曲线的制备。,4,结果计算,9/23/2024,11,水溶性维生素的测定,水溶性维生素,B,1,、,B,2,和,C,，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。,溶解性：,水溶性维生素都,易溶于水,，而不溶于苯、乙,醚、氯仿等大多数有机溶剂。,稳定性：在酸性介质稳定，既使加热也不破坏；,但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在,碱性条件下加热，可大部或全部破坏。,易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响，,维生素,B,2,对光，特别是紫外线敏感，易被光,线破坏 维生素,C,对氧、铜离子敏感，易被氧化。,9/23/2024,12,食品中水溶性维生素的测定,食品中维生素,B1,的测定,食品中维生素,B2,的测定,食品中维生素,C,的测定,食品中烟酸的测定,食品中维生素,B6,的测定,9/23/2024,13,一、维生素,B,1,的测定,维生素,B1,又称硫胺素、抗神经炎素。,测定方法：比色法,荧光法（,GB/T 12390-1990,）,HPLC,法,1.,荧光法原理,9/23/2024,14,硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。,本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响噻嘧色素荧光物质的样品。本方法的最小检出限为,0.05g,。,9/23/2024,15,2.,主要试剂,活性人造浮石,硫胺素标准溶液,3.,仪器设备,荧光分光光度计,Maizel-Gerson,反应瓶,盐基交换管,9/23/2024,16,Determination of water-soluble vitamins,5. Determination of Vitamin C,（抗坏血酸）,Characteristics of Vitamin C,Ascorbic acid (,抗坏血酸,), active,Dehydro-ascorbic acid (,脱氢抗坏血酸,), active,(2,3-,二酮古乐糖酸,), inactive,Total ascorbic acid,Oxidation,hydrolysis,食品分析中的所谓总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。,yyy,9/23/2024,17,Determination of Vitamin C,Fluorescence colorimetric method (,荧光比色法,),Principle,Ascorbic acid (,抗坏血酸,),Dehydro-ascorbic acid (,脱氢抗坏血酸,),Quinoxaline (,喹喔啉,), Fluorescent compound,oxidation,OPDA,(,邻苯二胺,),9/23/2024,18,Determination of Vitamin C,2,，,4-dinitrophenylhydrazine method (2, 4-,二硝基苯肼法,),Principle,Ascorbic acid (,抗坏血酸,),Dehydro-ascorbic acid (,脱氢抗坏血酸,),Osazone (,脎,), Red color,oxidation,2,4-DNPH,(,2, 4-,二硝基苯肼,),9/23/2024,19,Determination of Vitamin C,2,6-dichloro-indophenol redox method (2, 6-,二氯靛酚氧化还原法,),Principle,titration,还原型抗坏血酸 染料（粉红色） 脱氢抗坏血酸 染料（无色）,2,6-,二氯靛酚,H,+,9/23/2024,20,Determination of Vitamin C,HPLC,Sample treatment,称取一定量的样品用冷的,17%,的偏磷酸均质，离心，过滤。为测抗坏血酸，将,500L,的滤液同,115L,的,45% K,2,HPO,4,缓冲液（,pH9.8,）混合（混合后,pH,为,7.1,左右），混合液在,25,恒温,30min,，然后用,0.85%,偏磷酸稀释至,2mL,，取其稀释液,100L,，再用流动相稀释至,10mL,。若测脱氢抗坏血酸，加,1%,半胱氨酸至,45% K,2,HPO,4,缓冲液中，再与样液混合，后续操作与测抗坏血酸相同。,Chromatograph conditions,色谱柱：,2,根,PLRP-S,柱,250mm4.6mm,（,id,），,5m,串联；流动相：,20mmol/L,磷酸二氢钠,+0.17%,偏磷酸，,pH2.2,；柱温：,22C,；流速：,0.7mL/min,；检测器：安培检测器。,9/23/2024,21,二、维生素,C,的测定,维生素,C,是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。,水溶性维生素的测定,9/23/2024,22,维生素,C（,还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190192，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素,C,开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,9/23/2024,23,根据它具有的还原性质可以测定维生素,C,的含量。常用的测定方法有：,（1）2，6-二氯靛酚法 （还原型,V,C,）,（2）2，4-,二硝基苯肼法 （总,V,C,）,（3）,碘酸法,（4）碘量法,（5）荧光分光光度法,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,9/23/2024,24,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,1、原理：,还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素,C,的量成正比。,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,9/23/2024,25,2、试剂, 1%草酸溶液：称取10,g,草酸，加水至1000,ml；, 2%,草酸溶液：称20,g,草酸，加水至1000,ml；,维生素,C,标准液：准确称20,mgV,C,溶于1%草酸中，并稀释至100,ml，,吸5,ml,于50,ml,容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02,mgV,C,；,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,9/23/2024,26, 0.02%2，6-,二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50,mg，,溶于200,ml,含有52,mg,碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250,ml，,过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,2、试剂,9/23/2024,27,标定一：,吸标液（,V,C,）5ml,于三角瓶加6%,KI,溶液0.5,ml,加1%淀粉3滴用0.001,N KIO,3,标液滴定到淡兰色。,计算：,抗坏血酸浓度（,mg/ml）= （V,1, 0.088）/ V,2,V,1,-,滴定时消耗0.001,N KIO,3,标液的体积（,ml）,V,2,-,维生素,C,重量（,g）,0.088 -1ml0.001N KIO,3,标液维生素,C,的量（,mg/ml）,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,9/23/2024,28,标定二：,吸5,ml,已知浓度,V,C,标液 加5,ml1%,草酸 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点,计算：,每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素,C,的毫克数等于滴定度（,T）,T= （C V,1,）/ V,2,C -,维生素,C,的浓度（,mg/ml）,V,1,-,维生素,C,的体积（,ml）,V,2,-,消耗2，6-二氯靛酚的体积（,ml）,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,9/23/2024,29, 0.001,N KIO,3,标液：吸0.1,N KIO,3,溶液5,ml,于500,ml,容量瓶内加水至刻度，每毫升相当于,V,C,0.008mg；, 0.5%,淀粉溶液；, 6%,KI,溶液。,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,2、试剂,9/23/2024,30,4、注意事项, 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；, 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；, 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素,C；,贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（,Fe,2+,），,要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,9/23/2024,31,3、操作方法, 提取：,称样50,g,加2%草酸100,ml,到入捣碎机中处理过滤颜色若深可加白陶土, 滴定：,吸5,ml,样液于三角瓶用染料滴定至粉红色15秒内不褪色,计算：,V,C,（mg/100g）=（V T）/ W 100,V -,消耗染料体积（,ml）,T -1ml,染料所能氧化维生素,C,的毫克数,W-,滴定时所有滤液中含有样品的克数,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,9/23/2024,32, 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；, 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；, 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,4、注意事项,9/23/2024,33,（二）2，4-二硝基苯肼法,可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总,V,C,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,9/23/2024,34,1、原理：,用酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，在继续氧化为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2，4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎，其成色的强度与二酮古乐糖酸浓度呈正比，可以比色定量。,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法,9/23/2024,35,2、步骤, 样品处理与分析,称一定样 加等量2%草酸 于高速捣碎机捣碎 取匀浆20,g ,用1%草酸定容100,ml ,过滤 取滤液10,ml ,加1%草酸10,ml ,加少量活性炭 摇1分钟 静置过滤 各取滤液2,ml,于样品管和样品空白管 各管加入1滴硫脲溶液 于样品管中加入2，4-二硝基苯肼0.5,ml ,分别于两个管加盖 ,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法,9/23/2024,36,于37保温箱3小时 取出后样品管放入冰水中 样品空白管取出后冷至室温 在样品空白管加入2，4-二硝基苯肼 0.5,ml ,样品管和空白管都于冰浴中 滴加85%,H,2,SO,4,2ml,于各管中 边滴边摇 防止温度升高炭化后呈黑色 冰浴中30分钟后取出 室温下放置30分钟后，在540,nm,测消光值，从标准曲线上查出相应的含量,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法,2、步骤, 样品处理与分析,9/23/2024,37, 标准曲线的绘制,取5个50,ml,容量瓶编号 1 2 3 4 5,加,VC,标准液 10 20 30 40 50,ml,取5个比色管取相应 2 2 2 2 2,加硫脲溶液（滴） 1 1 1 1 1,2，4-二硝基苯肼（,ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5,于37保温箱34小时，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸2.5,ml,取出放30分钟在540,nm,下测各消光值绘标准曲线，同时做空白。,计算：,每百克食品中抗坏血酸的毫克数=,C/W *100,水溶性维生素的测定,二、维生素,C,的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法,2、步骤,yyy,9/23/2024,38,