分子生物学基因治疗

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,分子生物学基因治疗,一、基因治疗的概念,1990,人类第一例基因治疗获得,成功,1966,年，,Lederberg,提出基因治疗概念,基因治疗(,gene therapy),：将正常基因植入靶细胞代替遗传缺陷的基因,或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和治疗疾病的一种临床治疗技术。,人类疾病治疗的重大突破,!,与传统的方法相比较，从根本上消除遗传病因。,二、基因治疗类型和途径,生殖细胞基因治疗(,germinal gene,thrapy,),体外（,ex vivo）,间接基因治疗,体细胞基因治疗 (,somatic gene,thrapy,),1,、类型,2,、途径,体内（,in vivo）,直接基因治疗,1、基因矫正：原位修复缺陷基因,原位替换（同源重组）,2,、基因添加：正常基因非特异插入基因组以补偿,异常基因的功能缺陷,3,、基因失活：抑制、关闭异常表达的基 因,矫正突变,三、基因治疗的策略,4,、重新开放已关闭的基因,四、基因治疗的方法,（一）体细胞的基因治疗方法,2、受体细胞的选择,3 、将治疗转移到受体细胞内,4、将带有目的基因的细胞重新输回体内,体外基因治疗时,（二）反义技术（,antisense technology),（三）,RNA,干扰（,short interference RNA),1、治疗基因的制备,五、基因治疗的现状,1、一些单基因病的治疗,严重复合免疫缺陷症（,ADA,综合症）、血友病,B、,囊性纤维化（,CF），,苯丙酮尿症等,2、,Bata-,地中海贫血病 别醇嘌呤重新开放,r,基因,3、多基因病心血管疾病，糖尿病、神经系统疾病等,4、肿瘤,5、其它疾病：,HIV,六、基因治疗的问题、前景,问题：,1、,稳定性,2、安全性,3、导入基因的高效表达,4、免疫性,5、伦理问题,前景：,十分有潜力的技术，有深远的意义,“基因治疗作为一项新的治疗技术，将不只限于遗传病和肿瘤的治疗，在可见的将来，它将是临床上多种疾病可选择的治疗方法。”,应用腺苷脱 氨酶基因,ADA，,经逆转录病毒载体导入,严重复合免疫缺陷症（,SCID,）,遗传病的常规治疗,（一）外科治疗 矫正畸形、组织和器官移植,（二）内科治疗 用药物及饮食治疗,1、禁其所忌 酶缺乏不能对底物进行正常代谢,的遗传病。,2、去其所余 酶缺乏使体内贮存过多的“毒物”,所致的遗传病,促排泄剂或螯合剂 、换血或血浆过滤等,3、补其不足,由于基因缺陷使体内缺乏某种酶和蛋白质而导致功能丧失的遗传病。,ACGTCGGTACGTCGCTT,TGCAGCCATGCAGCGAA,ACGTCGGTGCGTCGCTT,TGCAGCCACGCAGCGA,ACGTCGGTACGTCGCTT,TGCAGCCATGCAGCGAA,突变基因原位修复,突变,修复,带异常基因的染色体,DNA,分子,带正常基因的外源同源片段,同源重组过程,添加正常基因,使,重新表达，形成,HbF,HbF,代偿,HbA,的功能。,目的基因的制备方法,1、从基因组中分离,2、化学合成,3、用,mRNA,逆转录合成,cDNA,4、,从基因文库中筛选,5、,PCR,合成,受体细胞的选择,选择受体细胞的原则：,1、易于从人体分离又便于输回体内,2、易于接受外源的遗传物质,3、能够分裂，生命周期长,4、患病的器官或部位。,常用的受体细胞：骨髓干细胞,皮肤纤纬细胞,血管内皮细胞,肝细胞,淋巴细胞,治疗基因的转移方法,3,、腺相关病毒,(Adeno-Associated Virus,AAV),4,、单疱疹病毒,(,Herpes simplex viruses ,HSV,),化学法,磷酸钙共沉淀,物理法 微粒轰击、电穿孔法 、显微注射,脂质体法,生物法 将病毒（,virus),改造成缺陷病毒载体,1、逆转录病毒载体（,Retroviruses,),2、腺病毒介导的基因转移（,Adenoviruses,）,脂质体法,优点：,易大量制备,无致病性,细胞类型多,治疗过程可控,缺点：,转化效率不高,血循中快速清除(肝巨噬细胞),逆转录病毒的改造,逆转录病毒感染细胞过程,逆转录介导基因转移的优缺点,优点：,1、,能高效率的感染宿主细胞（100%）,2、其宿主范围广泛，包括来自不同种的生物和细胞类型,3、被整合的基因在宿主基因组中稳定表达,4、用复制缺陷的重组逆转录病毒感染，毒性小,缺点：,1、只能感染分裂细胞,2、其外源,DNA,的容量太小,3、安全性问题（激活癌基因的潜在性）,腺病毒感染细胞的过程,腺病毒介导基因转移的优缺点,优点：,1、,具有较广的宿主范围，能感染除造血细胞以外的几乎所有细胞,2、,可以感染分裂及非分裂细胞,3、,能高效地感染宿主细胞,4、外源基因容量大,5、安全性较高（不引起癌基因激活）,缺点：1、,技术上需进一步改进,2、不整合到人类基因组,腺病毒是基因治疗载体的发展方向。,1,、野生型的,AAV,为非病原性，其安全性高,2,、,AAV,病毒颗粒的物理化学性质较为稳定,3,、应用宿主范围较广，使用于分裂及非分裂细胞,4,、可整合入宿主染色体上，可长期表达目的蛋白,腺相关病毒载体,优点：,缺点：,重组,AAV,的制作较为繁杂、,效率低，滴度,低,单疱疹病毒载体,优点,具有对神经元的特异的亲和力,可插入的基因片段容量很大，可达,40-50kb,缺点,对细胞有较大的毒性,反义技术,反义技术（,antisense technology),也称反义寡核,苷酸,是指利用人工合成的反义,RNA,或反义,DNA,来阻,断基因的转录或翻译，控制细胞生长的中间阶段，,使基因不能转录或翻译，因而不能合成蛋白质，以,达到治疗某中疾病的目的。,(1),将,cDNA,导入基因组中，转录得反义,RNA,(2),直接输入反义寡核苷酸,二、反义基因技术（阻断转录）,类型：,1,、反义,RNA,技术（阻断翻译）,转录阻断,反基因技术示意图,正常细胞,(无细胞毒性),胞嘧啶脱氨酶基因,erbB-2,启动子,5-,FC,5-,FC,5-,FU(,细胞毒性),肿瘤细胞,肿瘤特异性高表达因子,药物靶向治疗肿瘤,细胞死亡,RNA,干扰（,RNA interference RNAi ),2003年10大科学进展-第四 (,Science),正常生物体内一些小的双链,RNA,可以抑制特定基因表达的一种现象。当细胞中导入与内源性,mRNA,编码区同源的小双链,RNA (double stranded RNA，dsRNA),时，可以通过促使该,mRNA,降解来高效、特异的阻断体内特定基因的表达，从而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默,(,post-transcriptional gene silencing，PTGS),。,这些小的双链,RNA,称为,siRNA (Small/short interfering RNA，siRNA)。,RISC: RNA-induced,silencing complex,RNA,诱导沉默复合物,RNAi in gene therapy,基因治疗的现状-1,基因治疗的现状-2,基因治疗的现状-3,基因治疗的现状,-4,基因治疗的现状,-5,基因治疗的现状,-6,Hemophilia B,FIX function reduced, X-linked,Males to bleed after circumcision,第一例临床实验中国上海,1995-1996年,载体,AAV,自体皮肤成纤维细胞,两名血友病,B,患者(兄弟), 先后治疗了,四名患者,FIX,水平升高,2,倍并持续了1年以上,2003,年获得国家批准进行中国,首次,AAV,基因治疗血友病,B,临床试验,中国的基因治疗,AAV based gene therapy for hemophilia B,1.,Viral genes are removed from AAV,2.,A gene for blood clotting protein Factor IX is placed inside the empty AAV,3.,The Factor IX-bearing viruses are injected into the thigh muscle,4.,The viruses infect muscle cells, and the gene begins to produce the Factor IX protein that allows the blood to clot.,血友病,B,的治疗方法,中国的基因治疗,总体状况：,8,项进入临床实验，,6,项提出临床实验申请，近,30,项完成或进入临床前研究，,20,多项正在进行中试研究。,中国的基因治疗,谢谢大家！,