植物细胞转基因技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物细胞转化的方法种类及特点,1,植物转基因技术,的一般操作过程,2,间接转化法：,农杆菌介导法,病毒介导法,植物基因转化技术,方法,DNA直接,转化,法,：,基因枪法,电击法,花粉管通道法,化学物质诱导法,显微注射法,脂质体法,3,间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因方法,有农杆菌介导法和病毒介导法,。,间接转化法,4,农杆菌介导法是以,农杆菌,为媒介对植物进行遗传转化的方法。,1.,农杆菌介导法,5,它是通过根癌农杆菌的,Ti质粒,(,T,umer,i,nducing plasmid)和发根农杆菌的Ri质粒(,R,oot,i,nducing plasmid)上的一段,T-DNA区,在农杆菌侵染,植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细,胞并插入到染色体基因中。,6,T-DNA能够进行,高频率,的转移,而且Ti质粒和,Ri质粒上可以插入到,50kb,的外源基因,因此Ti质粒和,Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。,7,T-DNA,可以将其携带的外源基因,整合,到植物基,因组中,，,T -DNA,上较重要的是,T,区两端,左右边,界,各为 25,bp,的重复序列。其中14,bp,是中心,分,10,bp,和4,bp,两组,是完全保守的。这两个边界是,T -DNA,转移所必需的。其中尤以右边界最为重,要。,T-DNA,8,vir,基因,Ti 质粒的 vir 区大小为30kb ,分 VirA 、B 、C 、D 、E 、G 、H 等7 个操纵子,一共有24 个,基因共同控制着 T -DNA 的,加工和转移,它们总,称调控子。,9,叶盘,消毒,切取,土壤农杆菌浸泡,筛选培养基,愈伤组织,分化幼苗,10,优点,：,技术较,成熟,转化,效率高,操作简单,，,不需要特殊仪器,，,培养,周期短,外源基因多以,单拷贝,或低拷贝插入受体细胞,稳,定性好,，,减少了共抑制等基因沉默现象,。,可将较,大片段,DNA完整地转移到植物基因组中,等,。,11,缺点：,主要转化,双子叶,植物。,T-DNA可以在植物染色体的任何区域内插入,有可能导致有益基因的插入,失活,。,迄今所获得的近 200种转基因植物中80%以上是通过根癌农杆菌系统转化获得的。,12,病毒介导法是以,病毒,为媒介对植物进行遗传转化,的载体系统,。,具体来说就是将外源基因插入到病,毒基因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源,基因导入植物细胞的一种植物转基因方法,。,2.病毒介导法,13,利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效,率比较高,但它的,安全性,受到质疑,主要用于动物,的基因转移,。,14,直接转化法(又称DNA直接导入法),它指不依,赖于生物体将,裸露的DNA,直接转移到植物细胞和原,生质体中,导致细胞转化的技术,与间接转化法相比,直接转化法,不需构建载体,因此又叫无载体介导转化,法,。它,适用于对农杆菌侵染不敏感的植物,使用此法,的前提是需要建立良好的细胞或原生质体培养及再,生系统,。,DNA直接转移法,15,DNA直接导入法最大的优点是,无需选择宿主,可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染,色体的,频率低,。,该方法可以分为化学物质诱导法、,电穿孔法、脂质体法、,显,微注射法、基因枪法、,离,子,束介导法和花粉管通道法,。,16,基因枪法,电击法,花粉管通道法,化学物质诱导法,显微注射法,脂质体法,17,基因枪法最早是由美国康,奈尔大学的Sanford最先提出,的。它通过高速飞行的,金属颗,粒将包被,其外的目的基因,直接,导入到受体细胞内，,最后整合,到植物基因组并得以表达,从而,实现基因转化的方法。1992,年，,世界首例转基因小鼠就是,通过该法获得的。,1.基因枪法,18,DNA,1.2,m钨弹头,吸附,特制手枪,射击植物,装入,19,20,优点：,克服了受体材料的限制，,不必制备原生质体,。,实验操作简单易行,，,适合于,大多数细胞或组织,，,具有相当,广泛的应用,范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。,缺点：,进去的DNA片段,整合效率极低,，,遗传稳定性差，拷贝数多，,不易获得再生植株,。,21,至今为止,该法已成为除了农杆菌介导转化法,以外应用最广泛的基因转移技术。此法已在葡萄、,水稻等植物转基因中,应用,并获得转基因植株。基因,枪法也可以有效地用于叶绿体的转化,，,还可以转移,RNA、DNA克隆等。,22,是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的,原生质体,的,质膜上形成,瞬时可逆,性开放小孔,为外源DNA提供通,道,借此导入DNA等遗传物质,达到转化的,目的。,由,于质膜具有可修复性,外加电压造成的膜穿孔可在一,定的时间内,自动修复,从而使细胞恢复到正常的生理,状况,。,2.电击法,23,植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,1-2kV, 3-25,F电击,愈伤组织,幼苗,分化,24,优点,：,操作简便，,可以一次转化,许多,原生质体,，转化效,率较高，特别适于瞬间表达。,缺点,：,有,原生质体培养,的麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低,。,该法已在甘蔗、大麦小孢子、剪股颖等植物的基,因转化当中,。,25,花粉管通道法是利用植物授粉后,所形成的天然花粉管通道,经珠心通道,将外源DNA携带入胚囊,从而达到转化目的的一种植物转基因方法,。,3.花粉管通道法,26,优点,：,适用范围广,，,不依赖组织培养,人工再生,植,株；,可直接获得,转基因种子,，,育种时间短,，,在鉴定,时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快,捷；,转化速度较快,，,变异性状稳定较快；,方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备,。,27,缺点,：,转化受体受植物,花期的限制,，,同时必须充分了解,每一种植物的开花受精的时间过程。,在自然田间进行操作，受,环境,条件的影响很大。,操作的经验性很强,需要一定的,技巧,。,利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的,转基因植株。,28,化学物质诱导法是以,原生质体,为受体,借助于特,定的,化学物质,诱导DNA直接导入植物细胞的,方,法,。,常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、,PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PE,G,法应用较多,效果较好,。,PEG法是一种通过化学物质PEG处理去壁的原,生质体作为转化受体,改变细胞膜的通透性,使原,生质体获得转化的方法,。,4.化学物质诱导法,29,优点：,PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性,好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很,少产生。,30,缺点,：,原生质体培养再生难度较大；,原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白,化苗,，且,由于 PEG法对原生质体活力有害，,转化,率低,。,应用,这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡,椒等植物的转基因植株。,31,显,微注射法是使用毛细微管(一般针尖的直径为,0.5nm),在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞,或原生质体中的一种直接而完善的方法,。,5.显微注射DNA,32,该方法是Pena等1987年首创的,在用此方法进行,基因导入时,通常需要把原生质体或培养的细胞固,定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处理,使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进行操作,。,33,优点：,转化率高，特别是在没有合适的DNA载体系统时,更有价值,对转移物质没有限制,，,可选择受体细胞的核的接,受位点,受体不用特殊的选择系统,可以控制转移的量和转移物的浓度,34,缺点：,设备和技术的要求较高,要想获得转化的植株,需要注射大量的细胞或原生,质体，费时费工,对细胞有损伤,，,一次处理细胞数量不能太多,，比,较适合大细胞操作，主要用于动物的基因转化中,35,脂质体是根据生物膜的结构和功能特性,，,人工用,脂类化合物合成的双层膜囊,。,脂质体法,是Dellaporta等在1981年创造的,就是将,包含外源基因的脂质体与植物原生质体融合,从而,达到转基因目的一种转化方法,。,6.脂质体法,36,优点：,可避免DNA在导入受体细胞之前被核酸酶降解,；,适用的植物种类广泛重复性高,包装在脂质体内的,DNA或RNA可稳定地贮藏,。,37,缺点：,在包装DNA时必须有短时间的超声处理,会使相当,多的DNA断裂；,所用材料必使用具有全能性的原生质体作为受体,细胞；,转化效率较低,。,主要用于动物的基因转化,在植物上此方法介导的,基因转移在烟草、青菜等植物上有报道。,38,几种植物转基因方法比较,转基因方法,转化的优点,转化的缺点,DNA间接转化法,农杆菌介导基因转移,受体种类，可以在原生质体、和细胞团、组织器官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高；,转化,双子叶植物,为主。大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了该法在禾谷类作物中的应用。,转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以选择以淘汰未转化细胞,DNA直接转化法,1.,基因枪转化法,2.,电击法,3.,PEG介导基因转化法,4.,花粉管通道法,无宿主限制,，适用于各种单、双子叶植物，操作简单,转化,效率低,，需要,专门设备,（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数需要,原生质体,与愈伤组织，周期太长（电击法）,39,谢谢,！,40,