蛋白质的研究方法与原理

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 蛋白质的研究方法与原理,第一节 概 述,蛋白质的分离纯化包括以下过程：,1.,破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；,2.,将有关的蛋白质分级沉淀下来,;,（盐析法或有机溶剂法）,3.,应用,层析法,或,电泳法,使它们各自分开,；,4.,蛋白质结晶；,5.,蛋白质纯度鉴定和含量测定。,直接从生物组织中提纯蛋白,制备过程中注意事项,：,要求自始至终保持在,天然状态,避免一切过激因素,-,如过酸或过碱，高温，,重金属等的影响。,2.,通常都在低温条件下操作。,3.,尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高,水平。,第二节 蛋白质的分离与纯化技术,一、蛋白质沉淀与结晶,（一）,盐析法,概念,：将,中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及,PH,不同，加入不同浓度的中性盐可,使各种蛋白质依次分别沉淀出来。,优点：操作简便,对易变性的蛋白质有一定的保护作用，,适用范围十分广泛。,缺点：分辨能力差，纯化倍数低,（,1,）盐的种类,对同一种,Pr,而言，,价数愈高,的盐离子，盐析能力,也愈强,:,PO,3-,4,SO,4,2-,C,2,O,4,2-,（,CHOHCOO,-,）,2,AC,CL,NO,3,-,Br,-,I,-,CNS,-,K,+,Rb,+,Na,+,Cs,+,Li,+,NH,4,+,常用的中性盐,有如硫酸盐、磷酸盐等。,硫酸铵,（常用盐析剂）,优点：盐析能力较强,具有较高的溶解度,较低的溶解度温度系数,价格低廉,不产生副作用。,缺点：缓冲能力较差,PH,难控制,（,2,）,PH,和温度,S,。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度,除取决于,Pr,的种类，还受,PH,及温度影响,:,PH=PI,时，,S,。的数值极小,S,。随温度增加而减低。,盐析过程中，若增高温度，有助于,Pr,的析出。,（,3,）蛋白质浓度,Pr,较高,，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开,始析出，盐析界限比较宽。,Pr,较低,，需要无机盐的浓度也高，即盐析,界限变窄。,1.,基本原理,（,1,）在,PI,附近，,Pr,主要以中性离子形式存在。此时若添加,有机溶剂，由于,有机溶剂,可使溶液,电离,常数,减小，增强了,中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。,（,2,）,有机溶剂,本身的水合作用会破坏,Pr,表面的水合层，也,促使,Pr,变得不稳定而聚集析出,.,常用的有机溶剂：乙醇和丙酮,（二）有机溶剂沉淀法,分辨力比盐析方法高，提纯效果好,（三）选择性沉淀法,选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标蛋白质的分离方法。例如，将提取液加热至一定温度并维持一段时间，是某些不耐热的蛋白质变性沉淀等。应用选择星辰殿，徐实现对系统中需除去的及欲提纯的蛋白质的理化性质均有较全面的了解。,（四）蛋白质结晶,蛋白质结晶即是溶液中的蛋白质由随机状态转变为有规则排列状态的固体，常用语分析研究其结构。,蛋白质结晶是一个有序化过程，当蛋白质溶液达到过饱和状态，能够形成一定大小的晶核，溶液中的分子失去自由运动的能量，不断地结合到形成的晶核上，长成适合于,X,线衍射分析的晶体。,二、离心技术分离蛋白质,离心技术是利用物体告诉旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其它颗粒分离之目的。,三、层析技术分离纯化蛋白质,最基本的特征：,固定相,流动相,层析技术,（,chromatography,）,又称色谱技术，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。,各种物质得以分离的最基本原因：,就在于它们在这,两个相之间具有不同的分配系数,.,两相作相对运动时，,这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分,配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最,大的分离效果。,气相层析,按,两相状态,来分,液相层析,吸附层析,分配层析,离子交换层析,按,层析机理,来分,凝胶排阻层析,亲和层析,柱层析,按,操作方式,来分,薄层层析,纸层析,层析技术的种类,（一）凝胶过滤层析,又称,分子筛或凝胶过滤,（,gel filtration,）,原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。,离子交换层析法,*,原理：,阴,（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）,填充在层析柱内，由于,阴,（阳）离子交换树,脂颗粒上带,正,（负）电荷，能吸引溶液中的,阴,（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的,溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱,下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白,质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。,亲和层析法,原理,：,利用生物高分子具有能和某些相对应的专一,分子可逆结合的特性。,如，,酶的活性部位能和底物,抑制剂,辅助因子专,一性地结合,改变条件又能使这种结合解除,.,酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之,间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结,合蛋白与结合物之间,。,这些被作用的对象物质称之为,配基（,ligand),。,高效液相层析法,（,High Performance Liquid Chromatography,，,HPLC,）,又称“,高压液相色谱,，是,色谱法,的一个重要分支，以,液体,为,流动相,，采用高压输液系统，将具有不同,极性,的单一,溶剂,或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的,色谱柱,，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。,四、电泳技术分离蛋白质,电泳（,electrophoresis,）,是指带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS,(,十二烷基硫酸钠,),是阴离子型去污剂,(Sodium dodecyl sulfate, SDS),Q,u =,（迁移率）,6r,u,与,Q,、,r,有关,若蛋白质分子带有足够的电荷，在,SDS-PAGE,中进,行电泳，由于分子筛效应，,u,仅取决于分子的大小。,因此,SDS,一凝胶电泳可以按,蛋白质分子大小的不同,将其,分开。,这时，若以分子量的对数（,logM,）对相对于染料前沿,的迁移率（,Rf,）作图，呈现线性关系。,这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的,分子量范围：,5,胶浓度时，适用于分子量,6,200,万的区间；,10,胶浓度时，适用于分子量,1.6,7,万的区间；,15,胶浓度时，适用于分子量,1.2,4.5,万的区间。,聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱,等电聚焦电泳,（,isoelectric focusing, IEF,）,是一种根据样品的等电点不同而使它们在,pH,梯度,中相互分离的一种电泳技术。,利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个,pH,梯度。,pH,梯度制作利用的两性电解质（,ampholyte,，商品名为,ampholine,），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的,pKa,和,pI,值。在外电场作用下，自然形成,pH,梯度。凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,Pr,分子有一定的,PI,，它处在一个由,阳极到阴极,梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便,“,聚焦,”,在与其,PI,相同的,pH,位置上。,PI,不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。,优点：,1.,有很高的分辨率；,2.,可以区分等电点只有,0.01 pH,单位差异的蛋白质；,3.,根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；,4.,对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。,双向电泳,（,two-dimensional gel electrophoresis,）,第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳,-,PI,第二向采用,SDS,一凝胶电泳,-,分子量,由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不,同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率,可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。,是蛋白质组学研究的核心技术。,双向,PAGE,具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：,等电点（,pl),值很大或很小的，比如大于,8,和小于,4,的那些蛋白质；,分子质量很大的蛋白质，比如大于,l00kDa,的蛋白,质就比实际的少了，而大于,150kDa,的蛋白质就几,乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些,大蛋白质都能清楚地被观察到；,疏水性蛋白质。,双向电泳技术缺点,高效毛细管电泳,1.,毛细管区带电泳（,CZE,）,毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳,这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满，带电粒子的迁移速度依赖物质的荷,/,质比差异。,荷,/,质比越大，泳动越快。,2.,毛细管凝胶电泳（,capillary gel electrophoresis,，,CGE,）,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。,其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。,特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。,3.,胶束电动毛细管色谱,（,Micellar electrokinetic capillary chromatography,，,MEKC,）,缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,4.,毛细管等电聚焦电泳（,Capillary isoelectric focusing,，,CIEF,）,是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；,CIEF,是在毛细管内充有两性电解质，当施加直流电压（,6,8,V,）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的,pH,梯度；,具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点,pH,的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；此法可用于测定蛋白质的等电点、纯度鉴定、不同变异体的分析等。,5.,毛细管等速电泳,（,Capillary isotachophoresis,，,CITP,）,将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子,(,充满毛细管,),和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。,负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,6.,亲和毛细管电泳,（,affinity capillary electrophoresis, ACE,）,是毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离目的。,7.,毛细管电动色谱,（,Capillary electrokinetic chromatography,，,CEC,）,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以“电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。,第三节 蛋白质含量的测定方法,测定蛋白质含量的方法较多,基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物学活性建立起来的。,目前常用的有四种古老的经典方法,:,定氮法,双缩脲法,( Biuret,法,),，,Folin -,酚试剂法,(Lowry,法,),和紫外吸收法,.,另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法,( Bradford,法,).,其中,Bradford,法和,Lowry,法灵敏度高，比紫外吸收法高,10-20,倍,比,Biuret,法高,100,倍以上,.,凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。,一、凯氏定氮法,凯氏定氮法的原理基于蛋白质的平均含氮量为,16%,，通过测定样品中氮元素的量来计算出蛋白质的含量。,基本操作过程：,用硫酸对样品加热消化，蛋白质被硫酸氧化成,CO,2,和,H,2,O,，氮元素被还原成,NH,3,，并形成,(NH,4,),2,SO,4,；,加入强碱，使硫酸铵释放出,NH,3,，并将,NH,3,收集在无机酸液中；,用标准碱溶液滴定，确定,NH,3,量；,根据量确定样品含氮量，进而求得样品中的蛋白质含量。,(1) H,2,NCH,2,COOH +3H,2,SO,4, 2CO,2,+ 3SO,2,+ 4H,2,O + NH,3,(2) 2NH,3,+H,2,SO,4, (NH,4,),2,SO,4,(3)(NH,4,)SO,4,+2NaOH 2H,2,O+Na,2,SO,4,+2NH,3,此法灵敏度低,适用于,0.3-3.0,g,氮,误差为,2%,最大缺点,是受样品中非蛋白质含氮化合物的影响。测定前需用蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。,优点,凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。,1,、酒精灯,2,、蒸汽发生器,3,、长玻璃管,4,、橡皮管,5,、小玻杯,6,、棒状玻璃塞,7,、反应室,8,、反应室外壳,9,、夹子,10,、反应室中插管,11,、冷凝管,12,、锥形瓶,13,、石棉网,二、紫外吸收法,蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于,280 nm,附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系符合朗伯,-,比耳定律，因此，可用比色法直接测定蛋白质浓度。,在测定工作中，可以利用,280nm,及,260 nm,的光密度值求出蛋白质的浓度：,蛋白质浓度（,mg/mL,）,=1.45,A280nm0.74,A260nm,上式中的,OD280nm,是蛋白质溶液在,280nm,下测得的光密度，,OD260nm,是蛋白质溶液在,260nm,下测得的光密度。,优点：,1.,快速；,2.,对蛋白质无破坏性。,缺点：,1.,不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（,Tyr,）、苯丙氨酸（,Phe,）、色氨酸（,Trp,）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。 另外，当蛋白质分子中不含,Tyr,、,Phe,或,Trp,残基时，该方法就不能检出蛋白。（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）,2.,核酸可引起强烈干扰。,（一）考马斯亮蓝法（,Bradford,法）,考马斯亮蓝,G-250,法是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝,G-250,是一种染料，在游离状态下呈棕红色，在,465nm,下有最大吸收峰；当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是当蛋白质含量在,01000g,范围内，蛋白质,-,色素结合物在,595 nm,下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。,优点是：,（,1,）灵敏度高：蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为,1ug,蛋白质。据估计比,Lowry,法约高四倍。,（,2,）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需,2,分钟，结合物的颜色在,1,小时内是稳定的。因而完全不用像,Lowry,法那样费时和严格地控制时间。,（,3,）干扰物质少。如干扰,Lowry,法的,K+,、,Na+,、,Mg2+,离子、,Tris,缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、,EDTA,等均不干扰此测定法。,（二）,lowry,法,在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物,Folin-,酚试剂中的磷钼酸盐,-,磷钨酸盐被蛋白质中的,Tyr,和,Phe,残基还原，产生深兰色的钼兰和钨兰的混合物。,在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。在,680nm,处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。,优点：,操作简单、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，灵敏度比较高。,缺点：,Folin-,酚试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中的酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。,此方法受蛋白质特异性影响，蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸含量不同使得显色强度也不同，标准曲线也不是严格的直线。,此方法的初步显色是双缩脲反应，因此，凡是干扰双缩脲反应的基团（因素）都会干扰,Folin-,酚反应。,第四节 蛋白质结构分析方法,一、蛋白质的一级结构分析,步骤：,分离蛋白质样品必需纯（,97%,以上）。,测定蛋白质分子中多肽链的数目。,巯基乙醇处理,，使,二硫键还原为巯基,，产生单一多肽链。,分离纯化单一多肽链。,测定多肽链的氨基酸组成。,多肽链断裂 可采用特异的酶或化学试剂将多肽样品断裂成肽碎片，并将其分离开来。,对每一肽段进行测序。,确定肽段在多肽链中的次序。,确定蛋白质分子中二硫键及酰胺基的位置 以及磷酸化、糖基化位点。,（一）测序前的准备工作,1.,多肽链氨基端和羧基端分析,2.,多肽链氨基酸组成分析,3.,多肽链有限水解为若干个肽段,N-,端：丹酰氯,丹酰肽,-,层析分离鉴定,C-,端：肼解法，羧肽酶法,高效液相色谱 测定氨基酸的种类和含量,采用特异性的酶或化学试剂将单一多肽链有限水解为具有部,分重叠的若干个肽段。,（二）多肽链氨基酸序列测定,1.Edman,降解法,Edman,降解法：是肽链或蛋白质中,N-,端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔,埃德曼（,Pehr Edman,）首先创立。,原理：,用异硫氰酸苯酯（,PITC,）与待分析多肽的,N-,端氨基在碱性条件下反应，生成苯氨基硫代甲酰胺（,PTC,）的衍生物，然后用酸处理，关环，肽链,N-,端被选择性地切断，得到,N-,端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来，酸作用下，该衍生物不稳定，会继续反应，形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲（,PTH,）衍生物。余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用,HPLC,或电泳法分析生成的苯乙内酰硫脲（,PTH-,氨基酸），可以鉴定出是哪一个氨基酸。,每反应一次，结果是得到一个去掉,N-,端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下一个循环，继续发生降解。,优点：,能够可靠地测定肽链的,30,个左右氨基酸残基序列，最多可以分析,50-60,个氨基酸残基。在最好的条件下，每形成一次,PTH-,氨基酸，效率可保持在,99%,以上。而且此法用量少，,缺点：,由于,Edman,降解是以化学试剂对,N-,端氨基的修饰为基础的，因此当,N-,端被其他化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。此外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧化为,SO3H,，然后才能用,Edman,降解测定序列。,2.,质谱法,质谱技术基于串联质谱技术的氨基酸测序方法是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性这一特点而设计的,。,先测定某一肽段（如：,A,-B- C-D-E-F-G-,）以及从,C-,末端或,N-,末端去除一个残基的同一肽段（如：,B-C-D-E-F-G-,）各自的,分子质量,，二者之差值即为末端残基（,A,）的分子质量。,然后与,20,种标准氨基酸的分子量进行比较就可以确定末端氨基酸的本质了。,测定时：,实际操作时：,从质谱上得到的是一系列的多肽片段，每对大小相近的片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。,根据这一分子量差值的大小，较大肽段的末端残基即可准确判断。换句话说，从获得的一系列依次相差一个残基的肽段的分子质量中我们很快就可以确定最初样品多肽的末端序列（从,N,一末端或,C,一末端开始）。,二、蛋白质空间结构分析,（一）,X,射线衍射晶体分析法,（二）核磁共振法,（三）圆二色谱法,（四）傅里叶变换红外光谱法,（五）生物信息学预测蛋白质空间结构,（一）,X,射线衍射晶体分析法,X,射线本质,X,射线是一种短波长,(0.005,10nm),、高能量,(2.5,10,5,1.2,10,2,eV),的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。,X-,射线晶体结构分析基本原理,X,射线衍射分析所依赖的基本原理是,X,射线衍射现象,X,射线衍射现象,利用,X,射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。,当,X,射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使,X,射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。,衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的,距离,、,键角,，分子的,立体结构,、,绝对构型,、原子和分子的,堆积,、有序或无序的,排列,等。,（二）核磁共振法,1946,年美国,斯坦福大学,的,F.Bloch,和哈佛大学的,E.M.Purcell,两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获,1952,年诺贝尔物理奖。,1983,年,，瑞士科学家,Kurt W,thrich,教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（,glucagon,）多肽的溶液构象,.,发明了利用核磁共振,(NMR),技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了,2002,年度诺贝尔化学奖,NMR,基本原理,核磁共振,(Nuclear Magnetic Resonance),，,就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。,核磁共振波谱,是测量原子核对射频辐射,(,约,4,600MHz),的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。,核磁共振波谱仪,核磁共振法中几个常用的参数,化学位移,耦合常数,NOE,（核欧沃豪斯效应）信号强度,谱峰面积,弛豫时间,（,1,）化学位移,值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；,值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。,（,2,）耦合常数,核与核之间,以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数,用,J,表示。耦合常数用来表征两核之间,耦合作用的大小,。,J,耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分布的因素有关。,（,3,）,NOE,信号强度,当分子内有两个空间距离小于,0.5nm,的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称,核欧沃豪斯效应,（,NOE,）。,（,4,）谱峰面积,谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比，因此峰面积的积分值可用来做定量分析的基础。,（,5,）弛豫时间,原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫,弛豫时间,。,自旋晶格弛豫：,处于高能态的氢核，把能量转给周围的分子，回到低能态。,自旋,-,自旋弛豫 ：,两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。,二维核磁共振,(2DNMR,）,NMR,可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如,C-H,，,N-H,等就需要用到,2DNMR,，它是,2,个频率变量的函数，吸收峰对,2,个频率变量作图。,1,H-,1,H COSY,、,1,H-,15,N HSQC,核磁共振技术的应用,早期,核磁共振主要用于对,核结构和性质,的研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等,。,后来,广泛应用于,分子,组成和结构分析，,生物,组织与,活体,组织分析，病理分析、医疗诊断、产品无损监测等方面,（三）圆二色谱法,圆二色谱是研究,稀溶液,中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。,圆二色谱是利用不对称分子对,左、右圆偏振光,吸光率的不同来分析蛋白质的结构。,1969,年，,Greenfield,用圆二色光谱数据估计了蛋白质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋白质空间结构的报道逐渐增多。,平面偏振光,：,指振动方向在同一平面内的电磁波。,圆偏振光,：,当两束,振幅相等,、,互相垂直的,偏振光位相相差,1/4,波长,(90),时，其合成矢量绕光传播方向旋转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量,E,末端轨迹为圆形，所以称之为,圆偏振光,。电场矢量方向顺时针方向旋转的称为,右圆偏振光,，逆时针方向旋转的则称,左圆偏振光,。,椭圆偏振光,：,振幅不等的左、右圆偏振光合成,圆二色性和圆二色谱,圆二色性,：,当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就是圆二色性,光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的光成为椭圆偏振光，用,椭圆度,或,吸收差,表示,圆二色谱,：,指,椭圆度,(,或比椭圆度等,),与,波长,的关系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。,圆二色谱的应用,在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测定,生物大分子的空间结构,。,生物大分子很多是不对称的，即,光学活性分子,，通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下的二级结构,。,蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的,肽键、芳香氨基酸残基,及,二硫键,，另外，有的蛋白质,辅基,对蛋白质的圆二色性有影响。,肽键的不对称性使得它总有光活性,蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的,CD,光谱分为三个波长范围,:,1,）,250nm,以下的,远紫外光谱区,，圆二色性主要由肽键的,n,*,电子跃迁引起；远紫外,CD,主要应用于蛋白质,二级结构的解析,2,）,250,300nm,的,近紫外光谱区,，主要由侧链芳香基团的,*,电子跃迁引起；近紫外,CD,主要揭示蛋白质的,三级结构信息,3,）,300,700nm,的,紫外,-,可见光光谱区,，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。紫外,-,可见光,CD,主要用于,辅基的偶合分析,。,肽键,是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生,CD,谱带的位置、吸收的强弱都不相同。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外,CD,谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。,-,螺旋,结构在靠近,192nm,有一正的谱带，在,222,和,208nm,处表现出两个负的特征肩峰谱带；,-,折叠,的,CD,光谱在,216nm,有一负谱带，在,185,200nm,有一正谱带；,-,转角,在,206nm,附近有一正,CD,谱带，而左手螺旋,P2,结构在相应的位置有负的,CD,谱带，如上图和表所示。,- band(nm),+ band(nm),-,螺旋,222,，,208,192,-,折叠,216,195,-,转角,220-230(,弱,),，,180-190,（强）,205,左手螺旋,P2,结构,190,210-230,（弱）,无规则卷曲,200,212,CD,数据拟合计算蛋白质的二级结构的方法基本原理是假设蛋白质在波长,处的,CD,信号,(),是蛋白质中或多肽各种二级结构组分及由芳香基团引起的噪音的线性加，,()= f,i,(),i,+ noise,。,(),i,是第,i,个二级结构成分的,CD,信号值，,f,i,为第,i,个二级结构成分的含量分数，,f,i,规定值为,1,；通过已知蛋白（或称参考蛋白）二级结构的圆二色数据库，曲线拟合未知蛋白或多肽的圆二色数据，估算未知蛋白或多肽的二级结构。,蛋白质或多肽的二级结构拟合计算方法中，主要采用多聚氨基酸为参考多肽。,Greenfield,等采用多聚,L-lys,作参考多肽，建立,-,螺旋、,-,折叠及无规卷曲等二级结构参考,CD,光谱曲线，采用单一波长法（,208nm,）计算出,-,螺旋含量后，然后假设不同的,-,折叠含量（,X,）值，并假设,CD,值是,-,螺旋含量,(X,H,),、,-,折叠含量,(X,),无规卷曲,(X,R,),三者贡献值的加和，即：,X,H,+X,+X,R,=1,通过计算得到不同波长的,(),，得出计算曲线。假设一些不同的,X,值，分别求出它们相应的计算曲线，找出与实验曲线最接近的曲线，相应于该最接近曲线的,X,及,X,R,即认为是该蛋白质的相应结构含量。,Example fit: myoglobin(,肌红蛋白,),In this case:,q,t,=,x,a,q,a,+,x,b,q,b,+,x,c,q,c,fits best with,x,a,= 80%,x,b,= 0%,x,c,= 20%,agrees well with structure,78% helix, 22% coil,（四）傅里叶变换红外光谱法,傅里叶变换红外光谱法,(Fourier transform infrared spectrometer,FTIS),主要是对其红外光谱中酰胺,I,谱带进行分析。酰胺,I,谱带为,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角和无规卷曲等不同结构振动峰的加和带，彼此重叠，在,12601700cm,-1,范围内通常为一个不易分辨的宽谱带。目前常应用去卷积、微分等数学方法，使加合带中处于不同波数的,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角和无规卷曲等各个吸收峰得以分辨。最后经谱带拟合，获得各个吸收峰的信息。,（五）生物信息学预测蛋白质空间结构,1.,同源模建法,是预测蛋白质三维结构的主要方法，通过对蛋白质数据库分析可以得到结论：任何两种蛋白质，如果两者的序列同源部分超过,30%,，则它们具有相似的三维结构，及他们的基本折叠相同，只是在非螺旋和非折叠区域的一些细节部分有所不同。蛋白质的结构比蛋白质的序列更保守，如果两个蛋白质的氨基酸序列有,50%,相同，那么约有,90%,的,碳原子的位置偏差不超过,3%,。,主要步骤：,识别模拟的模板；目标序列和模板序列的排列；构建模型；构建非保守的,loop,区；安装侧链；模型修饰；结构合理性评估,2.,折叠识别法,也称穿线法（,threading,）。通过对已知的蛋白质结构的研究发现，大量序列同源性较差的蛋白质存在相同的折叠结构。折叠识别法就是利用已知蛋白质的折叠子为模板，寻找给定氨基酸序列可能采取的折叠类型，进而进行结构预测。,主要步骤：,建立模板数据库；构造打分函数；比对；预测,3.,从头预测法,蛋白质结构从头预测是不依赖模板仅从氨基酸序列信息得到天然结构。它的关键是正确定义能量函数、精确选用计算机搜索算法来寻找能量最低值。,第五节 蛋白质功能分析方法,一、酵母双杂交技术,利用杂交基因通过激活报告基因的表达，探测蛋白质,-,蛋白质的相互作用,。,酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要有二类载体,:,a,含,DNA -binding domain,的载体,;,b,含,Transcription-activating domain,的载体。,1,）两种蛋白之间是否有相互作用,2,）寻找一种蛋白可能的相互作用蛋白,应用,二、噬菌体展示技术,三、表面等离子共振技术,四、蛋白质芯片技术,生,物,芯,片,基因芯片,蛋白质芯片,微流控芯片,蛋白质芯片,又称,蛋白质阵列,或,蛋白质微阵列,，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。,（一）蛋白质芯片的分类,1.,根据应用分类,:,蛋白检测芯片,-,将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用于识别复杂生物样品中的目标蛋白,/,多肽。根据检测方法,不同蛋白质检测芯片又可进一步分为正相蛋白质检测芯片和反相蛋白质检测芯片。,蛋白功能芯片,-,天然蛋白点加在基片上，了解体系中哪种蛋白能与已知的某种蛋白结合，用于天然蛋白活性及分子亲和性研究。,2.,根据载体分类：,普通玻璃载体芯片,、,微孔型芯片,、,多孔凝胶覆盖芯片,3.,由,Ciphergen Biosystems,提出的,化学型蛋白质芯片,和,生物型蛋白质芯片。,蛋白质芯片的应用,临床检验及环境毒物检测所需的免疫检测和酶活性分析,高通量抗体筛选,蛋白质组学,研究生物大分子间的相互作用,蛋白质和小分子间的相互作用,药物靶标及其作用机理的研究,疾病诊断,食品中有毒有害物质的分析、在毒理学及卫生检验中的应用,五、免疫印迹技术,免疫印迹（,immunoblotting,）,又称蛋白质印迹（,Western blotting,），是检测蛋白质混合物中某种特定蛋白质的定性方法，也可以用于确定同一种蛋白质在不同细胞或同一种细胞不同条件下相对含量的半定量方法。免疫印迹也是利用抗原抗体特异反应的原理。,免疫印迹技术（,Western blotting),分三个阶段进行。,第一阶段：,十二烷基硫酸钠,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE),第二阶段：,电转移，将在凝胶中已经分离的蛋白条带转移到固相载体,(PVDF,膜）上，选用低电压（,100,伏）和大电流（,1,2A,），通电,60,分钟左右，转移即可完成。,第三阶段：,酶免疫定位：将印有蛋白质条带的,PVDF,膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带显色。,六、免疫共沉淀技术,原理,当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质,X,的抗体免疫沉淀,X,，那么与,X,在体内结合的蛋白质,Y,也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。,优点,：生理条件下的结合,缺点,：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用,方法,1),收获培养的细胞（,1,10,7,1,10,8,）冷,PBS,洗涤,2,次,2,）细胞裂解液裂解细胞，冰浴,30min,3) 12000rpm,离心,30min,4,）收集上清并加入适量抗体，,4,C,摇动,1h,过夜,5,）加入,ProteinA/G-Sepharose(,琼脂糖凝胶,),悬液，,4,C,摇动,1h,6,）细胞裂解液洗涤,ProteinA/G-Sepharose,混合液,7,）离心弃上清,8,）沉淀加,2,蛋白,Loading Buffer,煮沸,5,10min,9,）离心，上清液跑,SDS-PAGE,胶,10,）考马氏亮兰染色、银染,Western Blot,质谱分析,注意事项,1,）细胞裂解,采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（,NP40,或,Triton X-100),。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。,不能用高浓度的变性剂（,0.2,SDS),，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的,cocktailer,。,2,）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。,3),对照实验的设计。,七、,GST pull-down,技术,原理,细菌表达的谷胱甘肽硫转移酶（,GST,）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将,GST,融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀,GST,融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用,GST,沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。,两种应用：,1,）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用,2,）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用,方法：,1,）,GST,融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（,a,单一明确的重组蛋白；,b,，细胞裂解蛋白混合液；,c,体外翻译,cDNA,表达得到的未知蛋白）,2,）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应,4,C 2h,3,）离心弃上清,4,）沉淀加入,2,蛋白,Loading Buffer,煮沸，离心,5,）取上清进行,SDS-PAGE,电泳，,6,）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做,Western Blot,来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白,注意：,该实验设立,GST,对照，反应均在,4,C,进行。,八、生物信息学预测蛋白质的功能,利用生物信息学，通过搜索蛋白质序列一次数据库和蛋白质序列二次数据库，比较未知蛋白质是否与已知蛋白质结构相似，比较未知序列是否含有特殊蛋白质家族或功能的保守残疾等判断蛋白质的功能。此外，蛋白质的一些其他性质如信号肽、跨膜螺旋、卷曲螺旋等，可通过网络软件直接有序列计算得到。,思考题,蛋白质结构分析方法有哪些种？,蛋白质功能分析方法有哪些种，简述原理？,