14 多倍体与转基因动物

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第14章 多倍体与转基因动物,1,14.1 多倍体动物,动物多倍体比较少，原因：,（1）,高等动物远源杂交能力很弱，很难形成杂种个体；,（2）,多倍体动物高度不育，染色体异常通常会千万胚胎死亡，很难得到多倍体后代。,但,低等脊椎动物如鱼类、两栖类和爬行类,。,2,多倍体动物,产生原理,：染色体的加倍可以,通过保留受精卵第二极体即,抑制卵子,的第二次成熟分裂,或,抑制受精卵的第,一次卵裂,来实现。,鱼类精子入卵的时期是,第二,次减数分裂的中期,，刺激卵,子继续完成第二次分裂。卵,中原有的二组染色体中,一组,作为第二极体,排出受精卵成,为正常的二倍体。如果在精,子入卵时第二极体不能正常,排出，则精卵原核结合成为,三倍体受精卵,。,如果卵子受精后，照常排出,第二极体形成,单倍体卵,，单,倍的卵原核与,单倍的精原核,结合就形成二倍的受精卵，,这时再,抑制受精卵的第一次,卵裂,，则产生,四倍体,。,3,1 多倍体动物培育方法,A,物理方法,机制主要是通过,破坏微管形成,，使由微管蛋白聚合成的微管解体或阻止微管的聚合过程，,使染色体失去移动的动力，人为抑制染色体向两极移动,，形成多倍体细胞。,4,（1）温度休克法,：即用略高于或略低于致死温度的冷或热,休克来诱导,三倍体,(抑制第二极体排放)或,四倍体,(抑制第一,次卵裂)的方法。根据处理温度的高低分为,热休克法和冷休,克法,。一般,冷水性鱼类如蛙科鱼类，宜用热休克，温度范围,为,28-36,;温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为,0-5,左,右。,优缺点：,简便、廉价，但诱导率较低。,5,（,2,）,水静压法,：,采用较高的水静压（如,65kg/cm,2,）可抑制,卵母细胞第二极体的释放或,者抑制第一次卵裂诱导产生多倍,体的方法。,原理：静水压处理破坏了有丝分裂器中的,纺锤丝即纺锤体和星体,，,从而暂时阻断了有丝分裂的进程。,该方法处理程序标准化,易于掌握,，处理时间短(3-5min)，,诱导率较高，对受精卵损伤较小,。,但需,专门的设备,如水压机等。此外，静水压处理还使,染色体,发生了不同程度的凝缩，,还可能使,受精卵的结构,发生某些物理和化学变化，造成发育受阻，因此在生产中应用较少。,6,B 化学法,细胞松弛素诱导法,：细胞松弛素B(,CB,)导致极体的保留是,通过,阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离,来实现的。CB,处理比其他方法能更有效地诱导,三倍体,的形成。,6-甲氨基嘌呤诱导法,：,6DMAP,是一种蛋白激素酶抑制,剂。当6DMAP 与微管蛋白二聚体结合以后,对微管正常,的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生,三倍体,。,C 生物法：主要是远缘杂交法,瑞齐（Rasch）等于1965首先证明了三倍体脊椎动物可通,过四倍体个体与二倍体个体杂交产生。,化学法缺点：,成功率较低，且对胚胎及操作者有毒性，影响存活。,7,2 多倍体动物的鉴定,人工诱导处理过的群体可能是由多倍体、二倍体甚至是多倍体与二倍体构成的嵌合体等,混合群体,，所以需要筛选出需要的多倍体。,（2）核仁染色观察法,：一般而言，细胞,核仁数量与染色体组数目（倍性）成正比例,，通过,银染法,检测胚胎细胞核仁数量及分布情况可以鉴定多倍体，直观、可靠。,（1）染色体计数法：,将细胞固定制片、,染色后观察染色,体个数,。由于染色体制片技术比较成熟，因此该方法仍,是目前鉴定多倍体倍性的,一种直观、可靠的方法,，缺点,是比较费时。,8,（4）DNA含量测定：染色体组数与DNA含量成正比。,测定单个细胞的DNA含量，,根据细胞DNA比较来推断出细胞的倍性。如果发现杂种的DNA含量是其亲本的一倍半，就可以确定这些杂种是三倍体。,DNA含量测定法快速准确，能测出嵌合体，但是缺点是需要专门仪器。,（3）核体积测量法,：一般而言，,细胞核大小与染色体数,目成比例，,为了维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大,，细胞大小也按比例增加。因此,多倍体细胞及细胞核通常,要比二倍体大一些,。一般通过,测定红细胞核体积,的大小可以,鉴定染色体的倍性。缺点是比较费时、准确性不高。,9,14.2 转基因动物,1.,转基因动物,（transgenic animal）：是指在基,因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以,稳定地遗传给后代的基因工程动物。,利用,转基因动物生产人类药用蛋白、异体器官,等非常,规畜牧产品，是目前世界上转基因动物研究的热点之,一。,10,2.转基因动物培育方法,（,1,）,原核期胚胎,显微注,射法,：,几百KB大片段、应用广泛,目的DNA制备（无需构建载体）,DNA注入原核胚（受精卵雄核）,胚胎体外培养,胚胎移植（移植前鉴定）,发育,出生、鉴定,11,1980年,，Gordon等人首先,育成,转人生长素基因小鼠,。,世界第一个转基因动物,。,生长速度快24倍、体形,大一倍的转基因,“,硕鼠”。,发表在1982年的nature杂,志上。,原核期胚胎显微注射法,12,原核期胚胎显微注射法改进为体外受精转基因法,13,（,2,）,胚胎干,细胞方法,胚胎干细胞（,ES,）是一种含,正,常二倍染色,体的,具有发育,全能性的细胞,，因此只要,将,外源,DNA,导入,胚胎干细胞,就,可以实现基因,的转移。,14,（3）精子载体法：,精子与外源DNA混合培养，,DNA可被吸收进入精子头部，,然后再与卵细胞受精后发育成转基因动物。,（4）逆转录病毒感染法：,见11.10,。,（5）卵细胞显微注射法：,将,外源DNA克隆到逆转录病毒载体上，再显微注射到M II中期卵细胞（无核膜），,再体外受精，胚胎移植，发育成转基因动物。,15,Chapter 14,细胞工程,Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.,反转录,病毒感,染法,16,Chapter 14,细胞工程,Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.,东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪,绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆,17,Chapter 14,细胞工程,Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.,Genetically modified animal,GloFish,fluorescent fish, the first genetically,modified animal to be sold as a pet,18,目的基因,的鉴定：,检查动物体内是否有外源基因的,存在,，以判明是否是转基因动物。可用,聚合酶链反,应,(PCR),、斑点杂交,(Dot blot), Southern印迹,分析等多种方法进行检测。,目的蛋白,的鉴定：有活性的目的蛋白的检测非常重要。检测方法主要有：,(1) SDS,聚丙烯酰胺凝胶,(,SDS-PAGE,),(2),酶联免疫吸附实验,(,ELI,SA,),(3),Western,印迹分析,3 转基因动物鉴定,19,（1）快速生长与肉质改善,。,如转生长素基因的猪生长快，瘦肉率也高。,（2）增加羊毛产量和性能。,细菌基因SAT和DAS可以促进合成Cys，将该基因转入羊肠胃道上皮细胞，可提高羊毛产量。,若将毛角蛋白II中间细丝基因转入绵羊基因组中，所产羊毛光泽亮丽、毛脂含量高暖和。,（3）抗冻动物品种培育。,将鱼抗冻蛋白基因AFP,转入不耐寒鱼或其他动物。,4 转基因改良动物的应用,20,5,转基因动物,乳腺生物反应器,（,乳腺是最理想的药物蛋白生产场所,）,（1）概念：,将外源基因置于,乳腺特异性调节序列,之下，使之在乳腺,中表达，,然后通过,回收乳汁,获得重要,价值的,生物活性蛋,白,的技术。,21,1987,年,Gordo,n,等将,组织型纤溶酶原激活剂,(t,PA),与小鼠乳清酸蛋白,(WAP)基因的启动子构成,重组基因，成功地培育出了,37,只在乳汁中能表达,tPA,的转基因小鼠,.,2006年,6月2日，,世界上第一,个,利用,转基因动物乳,腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物重组,人抗凝血酶,（商品名：ATryn ）上市获得批,准。,目前，,1-,抗胰蛋白酶,(AAT)、人乳球蛋白、凝,血因,子,III,、,IV,、,VIII、纤维蛋白原、降钙素、,SO,D,、红细胞生成素、,IGF-1等成功表达，多种药,用蛋白已经进入临床试验阶段,。,22,上海交通大学医学遗传研究所：,（1）1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达,人凝血因子IX,蛋白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。,（2）1999年，带有,人血清白蛋白基因,的转基因试管,牛“滔滔”降生。,23,Chapter 14,细胞工程,Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.,1998,年上海医学研究所与复旦大学遗传所合作获得在,乳腺肿表达有生物活性的,人凝血因子,IX,转基因山羊,24,（2）关键环节,使用合适的,乳汁蛋白基因调控元件,，构建合理有,效的,乳腺组织特异性表达载体。,目前应用于乳腺特异性表达载体构建的乳蛋白基,因及调控序列的主要有：,乳清酸蛋白(WAP）基因及其调控序列。,酪蛋白(Icasein)基因及其调控序列。,-乳球蛋白(-lactoglobulin)基因及其调控序,列。,乳白蛋白(-lactalbumin )基因及其调控序列。,25,（3）存在问题,（,1,）,理论基础薄弱和技术不完善，致使转基因,在受体动物基因组,随机整合，遗传不稳定、表达,率不高,。,（,2,）,异位表达和表达产物的泄漏问题，需要,乳,腺组织特异性高效表达载体,，保证外源基因在乳,腺中专一表达。,（,3,）,在家畜转基因技术方面，目前多用,原核胚,胎显微注射,，平均,成功率比较低,，需要大量的供,体和受体动物。,26,