生物化学第三版13DNA生物合成

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,1,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1,概述,基因：遗传物质的功能单位。编码产物有蛋白质和,RNA,编码序列：,非编码序列,基因组：一个体细胞或病毒所含的一套遗传物质,中心法则,DNA,合成：复制、修复、逆转录,2,第一节,DNA,复制的基本特征,DNA,复制都需要,1.,半保留复制,2.,从复制起点双向复制,3.,半不连续复制,第二节,大肠杆菌,DNA,的复制,第三节,真核生物染色体,DNA,的复制,第四节,DNA,的损伤与修复,第五节,DNA,的逆转录,3,1.,半保留复制,4,生物化学第三版,5,2.,从复制起点双向复制,复制起点,：,DNA,解链和复制开始的,(,具有特定序列的,),位点,复制子,：从一个复制起点启动复制的全部,DNA,序列,复制叉,：在复制起点先解开双链，然后边解链边复制，在解链点形成分叉结构。,6,3.,半不连续复制,前导链,后随链,冈崎片段,7,第二节 大肠杆菌,DNA,的复制,一、参与,DNA,复制的酶及其他因子,（一）,DNA,聚合酶,（二）,解链、解旋酶类,（三）,引物和引物酶,（四）,DNA,连接酶,二、,复制过程,（一）,复制起始,（二）,复制延长,（三）,复制终止,8,聚合酶催化特点,需要模板,:,可以指导合成互补链的单链核酸,DNA,复制；转录；,RNA,复制；逆转录,需要引物：可以是,DNA,，也可以是,RNA,53,方向合成,2.,大肠杆菌,DNA,聚合酶的种类,3.,大肠杆菌,DNA,聚合酶功能,（一）,DNA,聚合酶,9,2.,大肠杆菌,DNA,的种类,Klenow,片段,复制合成的主要酶,10,DNA,聚合酶,I,II,III,53,聚合酶活性,35,外切酶活性,53,外切酶活性,53,聚合速度,(,核苷酸,/,秒,),16,20,40,250,1,000,延伸能力,3,200,1,500,500,000,功能,切除,DNA,复制引物，,DNA,修复,DNA,修复,DNA,复制合成,11,3.,大肠杆菌,DNA,聚合酶功能,53,聚合酶活性中心与聚合反应,35,外切酶活性中心与校对,53,外切酶活性中心与切口平移,12,13,14,15,(,二,),解链、解旋酶类,1.,解旋酶,2.,拓扑异构酶,3.,单链,DNA,结合蛋白,16,1.,解旋酶,helicase,解旋酶的作用是解开,DNA,双链。在解链过程中需要,ATP,提供能量，,每解开,1bp,消耗,2ATP,。目前在大肠杆菌至少已经鉴定出,4,种解旋酶，分别称为解旋酶,rep,、,、,和,DnaB,。其中只有,DnaB,参与,DNA,的复制,DnaB,是六聚体，能从复制起点双向解开,DNA,双链，形成两个复制叉。,DnaB,在后随链的模板上解链,，解链过程会在前方形成超螺旋结构，需要由拓扑异构酶松解,17,2.,拓扑异构酶,topoisomerase,拓扑连环数,是环状双链,DNA,分子两股链的互绕数。其他性质均相同、仅连环数不同的,DNA,分子称为,拓扑异构体,型拓扑异构酶,剪接单股,DNA,改变其连环数，从而改变其拓扑结构,型拓扑异构酶,剪接双股,DNA,改变其连环数，从而改变其拓扑结构,18,拓扑连环数,19,型拓扑异构酶（拓扑异构酶,、,）,消除负超螺旋，不消耗高能化合物，参与,RNA,的转录合成。,20,拓扑异构酶与切口的,5,磷酸结合,21,型拓扑异构酶,引入负超螺旋由,ATP,提供能量,22,3.,单链,DNA,结合蛋白,SSB,大肠杆菌的,DNA,双链解链后，两股单链即被,4,亚基,SSB,结合,SSB,与,DNA,的结合具有明显的协同效应，当第一个,SSB,结合后，其后,SSB,的结合能力可提高,10,3,倍,SSB,不沿,DNA,单链移动，而是通过不断的结合和解离改变结合位点,维持模板的单链状态，防止其重新形成双链结构；抗核酸酶降解,23,（三）引物酶,primase,DNA,复制需要,RNA,引物，,RNA,引物由引物酶催化合成。大肠杆菌的引物酶是,DnaG,，,DnaG,单独存在时无活性。当解旋酶,DnaB,结合其他复制因子辨认复制起点并启动解链时，,DnaG,与解旋酶,DnaB,结合，组成,引发体,(primosome),，在模板的一定部位合成,RNA,引物，合成方向也是,53,24,（四）,DNA,连接酶,ligase,LPB-25-963,大肠杆菌的,DNA,连接酶不能连接游离的单链,DNA,，只能连接双链,DNA,上的切口。,还参与,DNA,重组与,DNA,修复。,25,二、,DNA,的复制过程,（一）,复制起始,（二）,复制延长,（三）,复制终止,在大肠杆菌,DNA,的复制过程中，各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子结合在复制叉上，构成复制体,(replisome),。不同阶段的复制体具有不同的组成和结构。,26,（一）复制起始,1.,复制起点,2.,参与复制起始的酶和蛋白质,3.,起始过程,27,1.,复制起点,origin,LPB-25-959,起始解链区,DnaA,蛋白识别区,28,2.,有关的酶和蛋白质,蛋白,功能,DnaA,蛋白,识解复制起点序列,DnaB,蛋白,(,解旋酶,),DNA,解链，装配引发体,DnaC,蛋白,协助,DnaB,结合于复制起点,类组蛋白,HU,DNA,结合蛋白，促进起始,单链,DNA,结合蛋白,(SSB),保护单链,DNA,拓扑异构酶,II,DnaG,蛋白,(,引物酶,),松弛,DNA,超螺旋装配引发体，合成,RNA,引物,LPB-25-960,29,3.,起始过程,DnaA,蛋白与,ATP,形成复合物，大约,20,个,DnaAATP,复合物结合于,9bp,重复序列上，由,DNA,缠绕形成复合物,LPB-25-959,30,3.,起始过程,类组蛋白,HU,与,DNA,结合，使,13bp,重复序列解链，成为开放复合体,LPB-25-959,31,3.,起始过程,解旋酶在,DnaC,蛋白的协助下与开放区域结合，由,ATP,提供能量，沿,DNA,链,53,方向移动解链，形成两个复制叉结构,LPB-25-959,32,DnaG,与,DnaB,、,DnaC,等结合构成引发体；,SSB,与单链,DNA,模板结合；,II,型拓扑异构酶可松解超螺旋结构,33,（二）复制延长,延长阶段合成前导链和后随链。反应都由,DNA,聚合酶,催化，但有显著差别，参与合成的蛋白质也不完全相同,复制体成分,1.,前导链的合成,2.,后随链的合成,3.,前导链和后随链的协同合成,复制过程中的双重校对,34,复制体成分,蛋白质,功能,单链,DNA,结合蛋白,结合,ssDNA,DnaB,蛋白,(,解旋酶,),DNA,解链，形成引发体,DnaG,蛋白,(,引物酶,),装配引发体，合成引物,DNA,聚合酶,合成,DNA,DNA,聚合酶,切除引物，填补缺口,DNA,连接酶,连接,DNA,拓扑异构酶,改变超螺旋,LPB-25-962,35,1.,前导链的合成,2.,后随链的合成,LPB-25-960,36,前导链的合成后随链的合成,LPB-25-960,37,3.,前导链和后随链的协调合成,后随链的模板绕成一个回环，使后随链的合成方向与前导链一致。,38,3.,前导链和后随链的协调合成,LPB-25-961,39,LPB-25-955,复制过程中的保真机制,双重校对,聚合酶活性中心对底物的选择，,外切酶活性中心的校对。,40,（三）复制终止,终止区：,包括两个复制叉的,交汇点,和位于交汇点两侧的,终止位点,，含,7,个,终止序列,终止需要,Tus,蛋白,特异性地识别并结合终止序列的,共有序列,GTGTGGTGT,。每个复制周期只有一个,Tus-,Ter,复合物起作用,环连体：,复制结束时，两闭环染色体互相套成,环连体,，由,型,拓扑异构酶解离,实际情况可能更复杂,41,终止区,LPB-25-964,42,第三节 真核生物染色体,DNA,的复制,一、,染色体,DNA,复制特点,二、,DNA,聚合酶及其他因子,三、,端粒合成,43,一、染色体,DNA,复制特点,1.,复制速度慢：,50nt,1/20,2.,发生染色体解离与重塑：,3.,多起点：每个复制子控制的区域比较小,4.,冈崎片段小：,150,200nt,：,1000,2000,5.,连接酶差异：,ATP,：,NAD+,6.,终止阶段涉及端粒合成：,7.,受,DNA,复制检验点控制：一个细胞周期只复制一次。,44,二、,DNA,聚合酶及其他因子,：合成引物,：复制线粒体,DNA,、,：损伤修复,：复制染色体,DNA,45,三、端粒,DNA,合成,46,1.,端粒结构,telomere,端粒,DNA,含,短串联重复序列,，其新生链,(,后随链,),富含,C,x,A,y,(x,、,y,的数目为,1,4),重复序列，模板链则含,T,y,G,x,重复序列,四膜虫端粒：,5,CCCCAA,CCCCAANNNN,3 GGGGTT,GGGGTT,GGGGTTNNNN,2.,端粒功能：保护染色体结构的独立性和稳定性，抵抗外切酶的降解，防止遗传物质的丢失。细胞分裂计数器。,47,生物化学第三版,3.,端粒酶：有一段约,150nt,的,RNA,，含,CxAy,重复序列，可作为模板指导合成,3,端粒。,4.,端端粒复制,端粒酶结合于,DNA,的,3,端，以端粒,酶,RNA,为模板，催化合成端粒的一个单位。,48,端粒合成,端粒酶,RNA,含,C,x,A,y,，恰好作为端粒模板链的模板,端粒酶结合于端粒模板链,3,端,以,RNA,为模板，催化合成端粒模板链一个重复单位,端粒酶推进一个重复单位,重复合成，推进，达到一定长度,端粒酶脱离,端粒模板链末端回折,填补合成新生链空缺,49,第四节,DNA,的损伤与修复,一、,DNA,损伤,：变异即基因突变，化学本质是,DNA,的损伤，指,DNA,的碱基序列发生了可传递给子代细胞的变化。,1.,损伤的意义,是生物进化的分子基础,消灭有害细胞、个体,是许多疾病的分子基础,是多态性的分子基础,二、,DNA,修复,50,2.,损伤类型,错配：会导致,DNA,链上的一个碱基对被另一个碱基对置换。转换；颠换,插入和缺失：,DNA,序列上发生一个核苷酸或一段核苷酸序列的插入或缺失。,移码突变,：突变位点下游的遗传密码全部发生改变。,点突变：错配及一个核苷酸的插入和缺失所导致的突变,51,镰状细胞病点突变,52,（,3,）重排,53,（,4,）共价交联,54,3.,引起损伤的因素,复制错误,自发性损伤,物理因素,化学因素,生物因素,55,复制错误,56,自发性损伤,DNA分子可以由于各种原因发生化学变化，如碱基发生烯醇式酮式结构互变、碱基修饰、脱氨基甚至碱基丢失等。这些变化会影响氢键的形成，从而改变碱基配对。如果这些改变发生在DNA复制过程中，就会造成错配,57,物理因素,紫外线和各种辐射可以引起突变。如,*紫外线作用于相邻的胸腺嘧啶碱基形成二聚体,，在局部扭曲,DNA,双螺旋结构，使复制和转录均受阻抑；其他辐射可以使,DNA,主链的磷酸二酯键或,DNA,双链之间的氢键发生断裂等,58,化学因素,亚硝酸盐、烷化剂、染料和芳香烃类化合物等许多化学诱变剂可通过不同的作用机制导致,DNA,损伤,碱基类似物,碱基修饰剂,染料,59,碱基类似物,60,碱基修饰剂,61,染料,62,生物因素,抗生素和黄曲霉素等嵌入DNA双链之间，破坏DNA模板活性，或形成环氧化物，从而影响复制和转录过程,病毒整合等可以改变基因结构、或者改变基因表达活性。,63,二、,DNA,的修复,1.,错配修复,2.,直接修复,3.,切除修复,4.,重组修复,5.,SOS,应答和易错修复,64,1.,错配修复,mismatch repair,错配修复,就是在,DNA,复制完成以后，依赖模板提供的信息，对新生链上的错配碱基进行修复。错配修复可以将复制精确度提高,100,1,000,倍,识别双链,寻找错配碱基,切除修复,65,识别双链,LPB-25-968,66,寻找错配碱基,MutL,与,MutS,形成复合物，结合于错配位点,MutH,与,MutL,结合引导,MutL-MutS,复合物在错配碱基两侧寻找最近的一个,GATC,序列，形成,DNA,环,MutH,蛋白具有位点特异性内切酶活性，但只催化切割新生链所含未甲基化,N,*GATC,序列中,G,的,5,端，形成切口,LPB-25-969,67,切除修复,LPB-25-971,68,2.,直接修复,direct repair,直接修复,是指不切除碱基或核苷酸，直接将其修复,光修复修复嘧啶二聚体有多种机制，其中光修复作用是高度特异的直接修复方式。光修复由光裂合酶催化进行，光裂合酶被可见光激活，可以解聚嘧啶二聚体。光裂合酶分布很广，从低等单细胞生物到鸟类都有，但哺乳动物没有,烷基化碱基修复有些酶可以识别,DNA,中的修饰碱基，例如,O,6,-,甲基鸟嘌呤,-DNA,甲基转移酶可以识别,O,6,-,甲基鸟嘌呤，并直接将甲基转移到酶蛋白的一个半胱氨酸巯基上，使鸟嘌呤恢复正常结构,69,3.,切除修复,excision repair,切除修复是指将,DNA,分子的损伤部分切除，并以其互补链（完整的,DNA,链）为模板，重新合成被切除的片段，使,DNA,恢复正常结构。是细胞内最普遍的修复机制。,原核及真核生物均有两套切除修复系统,核苷酸切除修复系统,碱基切除修复系统,70,核苷酸切除修复系统,excinuclease,LPB-25-973,71,碱基切除修复系统,LPB-25-972,72,4.,重组修复,73,修复,DNA,损伤修复系统的修复能力与,DNA,的损伤程度相关。,DNA,损伤严重到难以继续进行正常复制时，细胞会诱发一系列复杂的反应，激活与损伤修复有关的基因，这一现象称为,SOS,应答。,诱导合成缺乏校对功能的,DNA,聚合酶进行修复，这种修复称为,SOS,修复。对碱基识别能力差，在损伤部位照样进行复制，从而避免死亡，但同时因保留较多的,DNA,损伤而造成突变积累。因此，不少诱发,SOSwhtjr,化学物质都是致癌物。,SOS,修复系统的基因一般情况下都是沉默的，紧急情况下才被整体激活，因此属于应急修复系统。,LPB-25-977,74,着色性干皮病,患者对日光尤其紫外线特别敏感，易患皮肤癌。其皮肤细胞中对紫外线特异的核酸内切酶有缺陷，不能切除嘧啶二聚体，是皮肤癌发生的主要机制,75,环境污染越严重越易产生双胞胎,2004,年,05,月,27,日新浪科技讯 北京时间,5,月,26,日,19,时消息，德国科学家最近的一项研究结果表明，环境污染越严重的地区越容易产下双胞胎。不久前，汉堡大学的科研小组在,职业与环境医学,杂志上发表文章称，在德国黑森州垃圾焚烧厂以北,20,公里的一个地方，双胞胎出生率,(5.3%),要比该项指标的平均数,(2.3%),高出,2,个多百分点。此外，根据德国国家统计局公布的资料显示，英国双胞胎的出生率自,1992,年以来也增加了,20%,。在比利时也存在着类似的发展趋势。,产生这一现象的具体原因目前尚未研究清楚，只能进行某些推测。,从医学角度来讲生育双胞胎是一种不良现象，这首先是因为双胞胎出生后体质都比较弱且体重较轻。来自伦敦夏洛特王后医院的妇产科教授尼克,-,弗斯克认为，产生双胞胎出生率呈上升趋势这一现象的原因可能是由于环境中的有害物质扰乱了妇女体内的激素平衡，使妇女体内雌激素标准降低，雌激素标准降低则能够导致机体内促性腺激素含量的增加，而激发卵细胞不断产生。,然而，我们常见的双胞胎大多数由同一个受精卵分裂而成。看来，要找到双胞胎出生率上升的真正原因，科学家们还得进行更深入的研究。,76,生物化学第三版,77,第五节,DNA,的逆转录合成,reverse transcription,逆转录,是以,RNA,为模板，以,dNTP,为原料，在逆转录酶的催化下合成,DNA,的过程,逆转录酶,逆转录病毒,逆转录的生物学意义,*抗,HIV,药物,78,逆转录酶,reverse transciptase,逆转录酶,具有,3,种催化活性,RNA,指导的,DNA,聚合酶活性,RNase H,活性,DNA,指导的,DNA,聚合酶活性,逆转录酶无校对功能，错配率高。这可能是各种,RNA,病毒突变率高，不断出现新病毒株的原因,79,逆转录酶,reverse transciptase,逆转录,复制,水解,80,逆转录病毒,81,3.,逆转录的意义,首先，逆转录机制的阐明完善了中心法则,研究逆转录病毒有助于阐明肿瘤的发生机制，探索肿瘤的防治策略,逆转录酶是重组DNA技术常用的工具酶，可以用于构建cDNA文库。,82,生物化学第三版,