第四章-海洋多糖

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糖,单糖,葡萄糖,果糖,开链结构及构型,具有多个手性中心,2,n,分子有旋光,开链结构式的表示,Fischer,投影式,上,下,(,氧化态),高,低,一对对映体,D-Glucose,L-Glucose,甘油醛,:,糖,构型表示法,D/L-,与甘油醛比较,D-Glucose,L-Glucose,D-(+)-,Glyceraldehyde,L-(-)-,Glyceraldehyde,D-,,,L-,型糖互为一对,对映体,自然界存在的糖大多数都是,D-,型,D-, L-,只用在糖、,-,氨基酸、,-,羟基酸的构型表示,D-,葡萄糖,D-Glucose,D-,甘露糖,D-Mannose,D-,葡萄糖,D-Glucose,D-,阿洛糖,D-,Allose,D-,葡萄糖,D-Glucose,D-,半乳糖,D-,Galactose,非,对映异构体,差向异构体:,在立体化学中,,含有多个手性碳原子的立体异构体,中,只有一个手性碳原子的构型不,同,其余的构型都相同的非对映体。,一些实验现象,缩醛,acetal,Glucose,熔点,146,配成水溶液, +112,Glucose,熔点,148150,配成水溶液, +18.7, +52.7,(1),(2),IR,中无羰基吸收峰,1,H NMR,中无醛基氢吸收峰,(3),变旋现象,Mutarotation,环状,结构及构型,如何解释变旋现象,(,Mutarotation,),?,糖,中的,-CHO,不是游离,的,而是以,半缩醛,的形式存在。,-D-(+)-,Glu, +112,m.p. 146C,-D-(+)-,Glu, +18.7,m.p. 150C,开链,D-(+)-,Glu,36.4%,0.5%,63.6%,(+112,) 36.4% + (+18.7)63.6% = 52.7,环状结构的表示方式,顺转,90,碳链卷曲,C4-C5,旋转,120,Fischer,投影式,Haworth,投影式,-D-(+)-,Glu,-D-(+)-,Glu,Haworth,式的书写规律,O,在后面,,C-1,在右边时(最常用的写法),,所有,D-,型糖的,CH,2,OH,均向上,,,L-,型则均向下,对,-D-,型糖,,C,1,-OH,向,下,;对,-D-,型糖,,C,1,-OH,向,上,。,L-,型糖则与,D-,型糖恰恰相反。,Fischer,式中在垂直碳链,右边的羟基,,在,Haworth,式中则向,下,;,Fischer,式中在垂直碳链,左边的羟基,,在,Haworth,式中则向,上,-D-,吡喃葡萄糖,-D-,吡喃葡萄糖,-D-,呋喃葡萄糖,-D-,呋喃葡萄糖,六元环,五元环,吡喃糖椅式构象中,,取代基占平伏键位,置越多,构象越稳定,糖苷,glycoside,CH,3,CH,2,OH,H,+,+,糖苷键,糖苷:也称,配糖体,,是单糖或寡糖的,半缩醛羟基,与另一,分子中的羟基、氨基、或巯基等,失水,而生成的化合物,熊果苷,尿道消毒,皮肤增白剂,黑芥子苷,祛痰、理气等药物的原料,苦,杏仁苷,毒性,甜菊苷,双 糖,一个单糖分子中的半缩醛羟基与另一个单糖分子中的羟基失水所得的糖,麦芽糖,蔗糖,-1,4-,糖苷键,-1,2-,糖苷键,-D-,呋喃果糖基,-,-D-,吡喃葡萄糖苷,4-O-(,-D-,吡喃葡萄糖基),-D-,吡喃葡萄糖,糖概述,单 糖,多 糖,多 糖,概述,理化性质,提取与分离,结构鉴定,海洋中的多糖,多 糖 概 述,多糖,(,polysacchrides,),是来源于高等动植物细胞膜、微生物细胞壁中的天然,大分子,物质,是所有生命有机体的重要组成成分与维持生命所必需的结构材料。,按结构不同分为:,淀粉、纤维素,、糖原、氨基糖、壳多糖等多种,纤维素,世界上最丰富的,天然有机物,,占植物界碳含量的,50,以上,是植物细胞壁的主要成分。,D-,葡萄糖,以,-1,4,糖苷键,组成的大分子多糖,分子量约,50000,2500000,,相当于,300,15000,个葡萄糖基。,造纸的重要原料,支链淀粉,淀 粉,植物体中贮存的养分,存在于,种子,和块茎中,淀粉是,葡萄糖,的高聚体,水解到二糖阶段为,麦芽糖,,,完全水解后得到葡萄糖。,淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。直链淀粉含几百个葡萄糖单元,支链淀粉含几千个葡萄糖单元。,多糖的生物活性,抗肿瘤活性:,香菇多糖,、黄芪多糖、芦荟多糖、紫草多糖、人参多糖、南瓜多糖,增强免疫作用:,香菇多糖、银耳多糖、黑木耳多糖、茶多糖,降血糖、血脂:,茶多糖、香菇多糖、黑木耳多糖,抗辐射、氧化:,螺旋藻水溶性多糖、银耳孢子多糖、枸杞多糖、螺旋藻多糖、褐藻多糖、海藻硫酸多糖、猴头菌丝多糖、红藻多糖、南沙参多糖,多 糖,概述,理化性质,提取与分离,结构鉴定,海洋中的多糖,多糖的理化性质,1.,无还原性和变旋现象;也无甜味。,2.,多糖通常为无定型粉末,一般具有很强的吸湿性。,3.,多糖一般,不溶于有机溶剂,,尤其是低极性的有机溶剂。,4.,多糖一般微溶于冷水,,易溶于热水中或稀碱水溶液,中。,5.,多糖有一定的,酸性,,尤其是有糖酸构成的多糖酸性较强。,多 糖,概述,理化性质,提取与分离,结构鉴定,海洋中的多糖,多糖的提取,热水提取法,:,破坏最小,甘薯去皮 切成小块,(0.30.30.3cm3) ,每组,15g (4,组共,60g),于搅拌器中 加蒸馏水,240,mL,捣碎,1min ,分成,4,份 ,3,层纱布过滤 ,滤液置,50,恒温水浴,30min ,倾去上层液体 ,25,mL,蒸馏水重新悬浮白色沉淀,室温下静置,15min,(两次) ,60,烘干,4h ,称重,用沸水提取,2-6,小时。提取液如粘度不大,则可采用,过滤法,过滤去残渣,对于粘度大的提取液则必须采用,离心法,去残渣,即得到多糖提取液或上清液。,例如:,大麦中活性多糖提取、大枣多糖提取、老头草中多糖的含量测定、乌龙茶多糖提取等。,提,取,淀,粉,稀碱水溶液提取法:,酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解度不大,所以常用,5-15%,NaOH,或,Na,2,CO,3,水溶液提取,*注意:,用稀碱溶液提取时,,温度必须保持在,10,以下,,否则多糖容易发生降解反应。通常在冷却的条件下,(4),,放置,6-8,小时,然后过滤或离心,滤液用稀盐酸调节,pH,至中性即得碱性多糖提取液。,或用稀酸水溶液提取,稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析,浓缩与醇析而获得多糖沉淀,酶解法:,在比较温和的条件中分解植物组织,加速多糖的释放或提取,粉碎的植物悬浮于水中,调节至,最适温度,(通常是,38-50,),最适,pH,范围,(通常是,pH3.8-4.5,),加入,5-25%,复合酶,,反应,4,小时,过滤去残渣,滤液即为多糖提取液,其它方法:,超声波提取,主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂,而且整个破裂过程在瞬间完成;同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解,加速植物中的有效成分进入溶剂,使其进一步增大了有效成分的溶出。,微波提取,靠微波电子管发出的电磁波,感应生电,又转化成分子的动能而发热,具有快速、高效、安全的特点;其次微波的频率很高,能透入物体的深度较深,对细胞的结构有较大作用,。,多糖的纯化,多糖提取液,:,含有许多杂质,主要是无机盐、单糖、寡糖、低分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质(如蛋白质、木质素),除杂质,分离,去除无机盐和小分子物质,除蛋白质,脱色,多糖的纯化,使用,透析袋,除去,无机盐、单糖、,寡糖和低分子量,的非极性物质,蛋白质除去通常采用方法:,1.,酶法,:蛋白酶将提取液中的蛋白质酶解。常用链霉蛋白酶,(,pronase,),,其方法是在,pH7-8,时,加入链霉蛋白酶,,37,消化,2-4,天,然后反应物于沸水中加热,5,分钟以阻断反应。,2.,Sevage,法,:蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性,将氯仿按多糖水溶液,1/5,体积加入,加入氯仿体积,1/5,的正丁醇,剧烈振摇,20,分钟,离心,分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白,特点:,条件温和,缺点是效率不高,一般要重复,5,次左右,3.,三氟三氯乙烷法:,等体积的三氟三氯乙烷加入到提取液中,在冷却的情况下搅拌,10,分钟,蛋白质成胶冻状,离心除去胶状蛋白质。上层水相再用上述溶剂处理,2,次,即得无蛋白质的多糖,特点:,此法效率较高,但因溶剂沸点较低,(b.p.56),,易挥发,且必须在低温条件下进行,不宜大量应用。,4.,三氯醋酸法,:在冰浴中搅拌的情况下缓缓于提取液中加入,15-30%,三氯醋酸,直至溶液不再继续混浊。在低温下(,4,)放置,4,小时。离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖提取液,特点:,由于三氯醋酸的酸性较强,往往会引起某些多糖的降解,所以操作必须在低温下进行,该法效率较高,常用于植物多糖的去蛋白,多糖的脱色,活性炭脱色法,活性炭对多糖有较强的吸附作用,多糖损失很大,一般不用,弱碱性离子交换树脂,去除多糖粗品中游离的色素。,对酸性多糖的吸附力强,故不宜使用。,多糖提取液,常有较深的色泽(一般为酚类化合物的聚合物),过氧化氢脱色法(氧化脱色),1,),将,0.3-0.8%,粗多糖水溶液用浓氨水调,PH,至,8,2,),50 ,加入过氧化氢(比例为,10-30%ml/g,),3,)在,50 ,下保持,2,小时,4,)醋酸调节至,PH7.0,,减压浓缩,5,),3,倍量乙醇沉淀,即得脱色的多糖。,该法在多糖粗品的脱色中常用。但必须严格控制脱色条件,如温度、时间、,PH,等。尽管如此,该法也会引起一定多糖的降解损失,。,多糖的分离,多糖,:,不均一性,,需要进行分级分离,先分析组分,根据组分的,摩尔比、特点、样品量,选择合适的分级方法,有机溶剂沉淀法,盐析法,金属络合法,季胺盐沉淀法,层析法,有机溶剂沉淀法:,原理:根据不同的多糖在低级醇或酮(通常是乙醇或丙酮)中具有不同溶解度而进行分离;分子量大的多糖较分子量小的多糖在乙醇(或丙酮)中的溶解度小,逐步加大乙醇(或丙酮)的浓度可将不同分子量的多糖分别沉淀出来,盐析法:,原理:根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有不同溶解度的性质分离各种多糖。,在多糖中加入中性盐如,NaCl,、,KCl,、,(NH,4,),2,SO,4,等至一定浓度,溶解度最小的多糖便沉淀析出,然后上清液继续加盐至更高浓度,则另一多糖又沉淀析出。,金属络合法:,原理:根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物而沉淀的性质进行多糖的纯化。,常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等,季胺盐沉淀法:,原理:长链季胺盐能与酸性多糖形成络合物,在低离,子强度的水溶液中不溶解的特性,使其沉淀析出,增加溶液的离子强度到一定范围,络合物则逐渐离,解,最终溶解。常用的季胺盐是十六烷基三甲基胺溴,化物及其碱、十六烷基吡啶,柱层析方法:,纤维素柱层析,:,不同浓度乙醇水溶液(如,80%,、,60%,、,40%,、,20%,)洗脱,洗脱规律:,先洗脱的是分子量最小的多糖,最终洗脱的是分子量最大的多糖,阴离子交换柱层析,利用多糖具有一定的酸性进行分离。,使用最多的方法,效果好,操作简单,凝胶柱层析:,根据多糖分子的大小和形状的不同即按分子筛的原理进行分离的,常用的凝胶有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶,展开剂为各种浓,度的盐溶液及缓冲液。,亲和色谱,用凝集素一般是蛋白质和糖蛋白作亲和色谱来分离多糖。,多 糖,概述,理化性质,提取与分离,结构鉴定,海洋中的多糖,多糖结构鉴定,纯度测定,分子量的确定,糖种类以及比例的确定,糖连接方式确定,糖构型的确定,纯度测定,超离心法:,超速离心机(带照相设备),多糖在离心场作用下形成单一区带,高压电泳法,:,电泳后呈单一色斑或单一峰,凝胶柱层析:,分步收集中出现形状对称的单一峰,旋光测定法:,比旋光度相同,高压液相色谱法,须经过两种以上的方法进行确定,【,原理,】,凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离,物质的分子大小不同,来进行分离的技术。,分子量的确定,凝胶柱层析,分离原理示意图,相对分子质量较大,的物质由于直径大于凝胶网孔,被完全排阻,在孔外,,只能在凝胶颗粒外的空间向下流动,因此流程较短,移动速度快;所以,首先流出,。,相对分子质量较小,的物质由于直径小于凝胶网孔,可,完全渗透,进入凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,因此流程较长,移动速率慢;所以,最后流出,。,中等大小的分子,,它们在凝胶颗粒内外,部分渗透,,渗透的程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二者之间,这样,分子大的组分先流出,分子小的组分后流出。,这样样品经过凝胶层析后,各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。,【,基本概念,】,外水体积、内水体积、,柱床体积 、洗脱体积,外水体积(,V,o,)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积,内水体积,(,V,i,)是指凝胶颗粒中孔穴的体积,柱床体积,(,V,t,)是指凝胶柱所能容纳的总体积。,V,s,为固定相体积,【,基本概念,】,洗脱体积,(,V,e,),是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。,它包括自加入样品时算起,到组分最大浓度出现时所流出的体积。,V,e,一般是介于,V,o,和,V,t,之间的。,对于,完全排阻,的大分子由于其不进入凝胶颗粒内, 故其洗脱体积,V,e,V,o,对于,完全渗透,的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内,故其洗脱体积,V,e,V,t,分子量介于二者之间的分子,它们的洗脱体积也介于二者之间。,凝胶层析柱洗脱曲线示意图,完全排阻的大分子,中等分子,完全渗透的小分子,洗脱体积的测定,外水体积(,V,o,),:,可以通过测定,完全排阻,的大分子物质的洗脱体积来测定,一般常用,蓝色葡聚糖,-2000,作为,测定,外水体积的物质。,内水体积,(,V,i,):,可以通过测定,完全渗透,的小分子溶质(如,重铬酸钾,)的洗脱体积来测定,柱床体积(,V,t,):,1),可用下式计算:,Vt,(,D/2,),2,h,2,)根据,Vt,V,o,V,i,可以得到,3,)加入一定量的水至层析柱预定标记处,然后测量水的体积,。,对于某一型号的凝胶,在一定的分子质量范围内,各个组分的,V,e,/V,o,与其分子质量的对数成线性关系:,V,e,/V,o,b,lg,M,r,+,c,通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱,分别测定,V,e,,,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后,在相同条件下测定未知样品的,V,e,,,通过标准曲线即可求出其分子质量。,糖种类以及比例的确定,1.,完全酸水解,操作:在,1M H,2,SO,4,中封管,100,o,C,水解,8,小时,用碱中和。,水解的难易程度与组成多糖的单糖性质、单糖环的形状和糖苷键的构型有关:,一般,呋喃,糖苷键较,吡喃,型易水解,,型,较,型,易水解,含有,糖醛酸,或,氨基糖,的大多不易水解,HPLC,法:,流动相为,乙腈,-,水,(,85,:,15,),流速,1.0mL/min,,示差检测。,气相色谱法:,将水解样品进行,NaBH,4,还原和,乙酰,化制成糖醇乙酸酯衍生物。,或将水解样品进行,硅醚化,,而后再进行分析。,薄层法,纸层析法:展开剂大多为含水的溶剂系统,如,正丁醇,-,醋酸,-,水,(4:1:5),,,EtOAc,-,吡啶,-,水,(2:1:2),等。,硅胶薄层法:常用的展开剂为,正丁醇,-,丙酮,-,水,、,正丁醇,-,醋酸,-,水,或,正丁醇,-,吡啶,-,水,。,2.,糖的分析(包括种类和比例分析),糖连接方式的确定,Haworth,法:,试剂:,硫酸二甲酯和氢氧化钠,(,或碳酸钠、碳酸钾,),缺点:甲基化能力较弱,欲进行全甲基化反应,必须进,行多次反应。,甲基化:将多糖中的游离羟基全部甲基化,进而水解后,得到的化合物,其羟基所在的位置即为原来单糖残基的,连接点。根据不同甲基化单糖的比例,可以推测这种连,接键型在多糖重复结构中的比例,甲基化方法,Purdie,法:,试剂:,碘甲烷和氧化银,为试剂,(,一般可在丙酮或四氢呋喃中进行,),缺点:氧化银有氧化作用,不能用于还原糖的甲基化。,改良的方法:,碘甲烷和四甲基脲,Hakomori,法:,试剂:,碘甲烷、甲基亚磺酰甲基钠(,SMSM), DMSO,为溶剂,缺点:需重复数次,反应进行程度的判断:,红外检测,无羟基吸收,表明甲基化完全,甲基化,水解,检测,高碘酸氧化、,smith,降解,IO,4,-,KBH,4,H,+,+,以,1,4,位键合,赤藓醇,2IO,4,-,KBH,4,H,+,+,以,1,6,位键合,糖苷键构型的确定,(,1,) 利用酶水解进行测定,麦芽糖酶,一般能水解的为,-,苷键,能被,苦杏仁苷酶,水解的大多为,-,苷键。,(,2,)利用波谱法测定,红外光谱法:,-,苷键,890 cm-1,-,苷键,840 cm-1,核磁法,利用,端基质子,的偶合常数,对于葡萄糖,-,苷键,J,7Hz, -,苷键,J,3Hz,利用,-,苷键和,-,苷键的,端基碳,的化学位移差别,利用,2D NMR,谱,胡萝卜苷,多 糖,概述,理化性质,提取与分离,结构鉴定,海洋中的多糖,海洋动物多糖,海藻多糖,粘多糖:氨基多糖,海藻多糖,褐藻多糖,褐藻胶:,为甘露糖醛酸和古罗糖醛酸构成的线性多糖。,褐藻糖胶:,主要组成成分为硫酸化的岩藻糖。,海带淀粉:,是一类葡聚糖,其生理功能类似于植物中的淀粉。,红藻多糖,琼胶、卡拉胶,绿藻多糖,微藻多糖,琼胶和卡拉胶,两者均为细胞壁填充物,且均为,半乳糖,琼胶:,琼胶由,琼胶糖,和,琼脂果胶,二部分组成,,琼胶糖,是不含有硫酸酯盐的,非离子型多糖,,是形成凝胶的组分;,琼脂果胶,是非凝胶组分,是带有,硫酸酯盐,葡萄糖醛酸和丙酮酸醛,的复杂多糖,也是在商业提取中力图去掉的部分。,卡拉胶:,在食品工业中主要用作胶凝、增稠、稳定和持水剂功能,在奶制品饮料中用作悬浮剂;在布丁、酸奶、掼奶油、冰淇淋、奶酪中用作增稠稳定剂;在红肠、洋火腿生产中用作持水剂 ;果冻中用作胶凝剂,琼 胶 糖,A: (,),酸水解,A,A,E: (,),酶水解,E,琼二糖,琼四糖,新琼二糖,新琼四糖,琼二糖,新琼二糖,蓝色标记:,3,6-,内醚,-L-,半乳糖,绿色标记:,D-,半乳糖,壳多糖和壳聚糖,壳多糖,又名甲壳素、几丁质,广泛存在于虾、蟹和昆虫等节肢动物的外壳和菌、藻的细胞壁中,是自然界中最为丰富的生物高分子之一,尤以在海洋虾、蟹中的资源蕴藏量最大,N-,乙酰基,-D-,氨基葡萄糖通过,-1,4-,苷键相连的直链氨基多糖,不溶于水、稀酸、稀碱和其他有机溶剂,壳多糖:聚,N-,乙酰基,-D-,氨基葡萄糖,壳聚糖:壳多糖在,碱性,条件下水解,脱去部分乙酰基后转变而成,壳聚糖:聚,D-,氨基葡萄糖,半透明、略有珍珠光泽的片状固体,不溶于水和碱,因分子中有,-NH,2,基,呈碱性,可溶于稀酸中,,形成粘性溶液,自然界,唯一带正电荷,的天然活性多糖,壳寡糖:,壳聚糖降解为,210,个氨基葡萄糖单位,稀酸处理:,先用稀盐酸浸泡蟹壳和虾壳使得钙、镁等的碳酸盐变成盐酸盐溶于水中,由于其主要成分是碳酸钙,故又叫脱钙反应。,稀碱处理:,壳中的蛋白质数量也很大,由于其在碱中溶解快且完全,对甲壳素的降解又小,所以就再用稀碱,浸泡来脱去蛋白,脱钙和脱蛋白以后的蟹壳或虾壳就是甲壳素,甲壳素的提取,壳聚糖曾在,1991,年被欧美学术界誉为继蛋白质、脂肪、,糖类、维生素和无机盐之后的第六生命要素。,化妆品,:保湿,成膜,:,能溶解于弱酸中,是很方便的成膜材料,而且这种膜是可食用膜,同时又可在水和热水中保持原状,因此特别适合于固体、液体食品的包装。香肠肠衣类的膜也是壳聚糖与其他物质复合制成的。,保鲜,:,可抑制细菌、霉菌生长,因此常加于腌制食品中或用于海产,(,虾,),、水果,(,荔枝、猕猴桃,),的保鲜。,吸收性手术缝合线,:,既能满足手术操作时对强度、打结性能以及柔软性的要求,同时还具有消炎止痛促进伤口愈合的功效,又能被体内溶菌酶分解成糖蛋白为人体吸收。,抑制肿瘤,降胆固醇、降血压、防治糖尿病、强化肝脏功能、治疗烧、烫伤,等等。,肝素类似物,肝素中的五糖结构,R=COCH,3,or SO,3,-,硫酸多糖:抗凝血作用,海洋多糖的构效关系,构效关系:,研究化合物的化学结构因素(信息)与生物活性间的变化规律,即,SAR,(,Stucture,-activity relationship),多糖的组成和糖苷键的类型,分子量的大小,分支度,高级结构,溶解度,降解,改变取代基,结构修饰,影,响,因,素,
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