红细胞计数红细胞形态检查血红蛋白测定

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,2020/11/3,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/3,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,红细胞计数红细胞形态检查血红蛋白测定,红细胞计数红细胞形态检查血红蛋白测定红细胞计数红细胞形态检查血红蛋白测定,目的要求,1.,掌握：红细胞计数、氰化高铁血红蛋白测定的原理、方法、质量控制、参考值、方法学平价及临床意义 ；,红细胞形态。,2.,了解：血红蛋白测定其他方法 。,重点,:,红细胞计数、血红蛋白测定的原理、血片 红细胞形态、,难点,:,红细胞检验的形态、质控。,目的要求,一、概 述,1.,红细胞的生成,骨髓造血干细胞,-,红系祖细胞,-,原红细胞,-,早幼,-,中幼,-,晚幼,-,网织红细胞,-,成熟红细胞,Epo,每个原红细胞可以生成,16,个红细胞。,48h,无分裂能力,2.,红细胞的破坏,健康人红细胞平均寿命,120,天。,红细胞主要因衰老而消亡，破坏主要在单核,-,巨噬细胞系统，器官主要是在脾脏和肝脏；其次为骨髓和其他部位。,二、红细胞计数,红细胞计数（,red blood cell count,RBC,）即测定单位体积内红细胞数量。是血液一般检验的基本项目，常作为诊断贫血和红细胞增多的主要指标之一。,测定方法,显微镜计数法,血液分析仪法,（一）显微镜计数法,【,检测原理,】,采用等渗稀释液将血标本稀释一定倍数，滴入血细胞计数室中，显微镜下计数一定区域内红细胞数，经换算得每升血液中红细胞数量。,【,器材,】,微量吸管，采血针，小试管，计数板，盖片，棉球，显微镜。,【,试剂,】,红细胞稀释液：任选一种,1.Hayem,稀释液,：氯化钠,1.0g,、硫酸钠（含,10,个结晶水）,5.0g,，氯化高汞,0.5g,，蒸馏水加至,200mL,，过滤后使用。,氯化钠,-,调节渗透浓度,硫酸钠,-,提高比重防止红细胞粘连,氯化高汞,-,防腐剂，有毒,2.,柠檬酸盐甲醛盐水,氯化钠,0.6g,调节渗透压,柠檬酸钠,1.0g,调节渗透压，抗凝,36%,甲醛,1ml,防腐,蒸馏水加至,100ml,，过滤,2,次后使用。,3.,生理盐水或加,1%,甲醛的生理盐水,【,操作,】,1.,中号试管（,15100mm,）加等渗稀释液,2ml,；,2.,毛细血管采末梢血,10l,加入上述稀释液，立即摇匀（稀释,200,倍）；,3.,充池，静置,2min,后以低倍镜计数中间大方格内四角和中央,5,个中方格内的红细胞数。,未染色红细胞呈双凹盘形，有黄绿色折光。,红细胞计数,2ml,稀释液 充分混匀,10ul,血液 充池、静止 镜下计数,2020/11/3,13,3mm,WBC WBC,WBC WBC,1mm,2020/11/3,14,红细胞数,/L=5,个中方格内红细胞,5 10 200 10,6,/L,或,= 10,12,/L,5,个中方格内红细胞数,100,【,报告方式,】,【,计算,】,RBC,（,/L,）,= . 10,12,/L,【,方法学评价,】,1,手工显微镜法,2,血液分析仪法,为目前主要临床检验细胞计数方法,变异系数（,coefficient of variation, CV,）小。,【,质量控制,】,1,手工法 误差来源包括：标本、操作、器材、固有误差（计数域误差）,2,仪器法,严格按操作规程；定期作室内和室间质控。,【,参考值,】,男性,:,（,）, 10,12,/L,女性,:,（,）, 10,12,/L,新生儿,:,（,）, 10,12,/L,【,校正,】,WBC10010,9,/L,时，需校正：,实际红细胞,/L=,所数细胞总数,白细胞数,（正常红细胞：白细胞,=750,：,1,可忽略白细胞的影响）,【,注意事项,】,1.,采血及摇匀迅速，防止血液凝固；,2.,器械应防酸防碱且干燥；,3.,充池要摇匀；,4.,计数时，应识别酵母及白细胞。,三、血红蛋白测定,（一）血红蛋白的结构,血红蛋白结构： 由珠蛋白和亚铁血红素结合组成。,Hb,色素部分：亚铁血红素,蛋白质部分：珠蛋白,Fe,2+,原卟啉,空间结构：每个血红蛋白有,4,条珠蛋白肽链，,每条肽链包裹,1,个亚铁血红素，形成具有,四级空间结构的四聚体。,【,分类,】,（每个珠蛋白分子含两条,链和两条非,链）,正常人：,HbA,（,2,2,） 占,90%,成人主要血红蛋白；,HbA2,（,2,2,） 占,2%-3%,成人次要血红蛋白,HbF,（,2,2,） 占,2%,以下 胎儿主要血红蛋白,生理情况下，,99%Hb,的铁呈,Fe,2+,状态，称为还原血红蛋白，亚铁状态的,Hb,与氧结合称氧合血红蛋白（,HbO,2,).,1%Hb,的铁呈,Fe,3+,状态，称为高铁血红蛋白（,Hi,）。,Hb,的合成受激素的调节：,Epo,和雄激素。,注意事项,：,1.,如,-,链或,-,链合成障碍，使三种正常血红蛋白比例异常，即各型地中海贫血；如多肽链发生氨基酸置换、丢失、加长，称为血红蛋白病 。,2.,病理情况下可出现硫化血红蛋白（,SHb,）。,（二）血红蛋白衍生物及其吸收光谱,1.,氧合血红蛋白（,oxyhemoglobin, HbO,2,）,:Hb,与,O,2,结合时形成。,2.,还原血红蛋白（,reduced hemoglobin, Hbred,）：未与,O,2,结合时的,Hb,。,3.,高铁血红蛋白（,hemiglo -bin, Hi,）或正铁血红蛋白（,methemoglobin, Mhb,）,: Fe,2+,被氧化成,Fe,3+,。,4.,碳氧血红蛋白（,HbCO,）、硫化血红蛋白（,SHb,）：与,O,2,结合的配位键被,CO,、,S,等占据。,5.,氰化高铁血红蛋白（,HiCN,）：,Hi,与,CN,-,结合而成。波峰,540nm,，波谷,504nm,。,正常情况下，血液中血红蛋白主要是,HbO,2,和,Hbred,，以及少量,HbCO,和,Hi,。,（三）血红蛋白测定方法,手工法：,HiCN,法,SLS-Hb,法,AHD,575,法,HiN,3,法,血液分析仪法,1,、氰化高铁血红蛋白（,HiCN,）测定法,1,）原理,：在,Hb,转化液中，,除,SHb,外，,Hb,被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与,CN,-,结合，生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白（,HiCN,），吸收峰为,540nm,，毫摩尔消光系数为,44 Lmmol,-1,cm,-1,。因此根据标本的吸光度，即可求得血红蛋白总量（不含,SHb,）。,2,）器材,：,分光光度计、移液管、微量吸管、试管等。,3,）试剂,：血红蛋白转化液（文齐液）成分如下,高铁氰化钾：使,Hb,转化成,Hi,氰化钾：使,Hi,形成,HiCN,无水磷酸二氢钾：防止混浊，调节,pH,值,TritonX100:,非离子型表面活性剂，加速溶血，缩短转化时间，防止因血浆蛋白改变引起的混浊。,4,）操作：,a.,取指血,20ul,，加到,5ml,血红蛋白转化液中，混匀，静置,5,分钟。,b.,用分光光度计比色。波长,540nm,，以空白转化液调零，测定吸光度“,A”,。,5,）计算,标准状态下的计算,Hb,（,g/L,）,=A 251,A 367.7,其中，,A,为测得的吸光度，,64458,为,Hb,的分子量，,251,为测定时血液稀释倍数，,44,为,HiCN,的毫摩尔吸光系数，,1000,为换算成摩尔吸光系数。,64458,441000,非标准状态下的计算：求换算常数,K,标准液标定,Hb,液浓度,(,标准值,),K= -,本室测定标准液的“,A” (,测定值,),标本,Hb g/L =,标本测定值,A,举例：用不同浓度的,Hb,的标准品：,50,，,100,，,150,，,200g/L,测得的吸光度分别为,0.13, 0.27, 0.41,和,0.54,。则,K,值为,K= = =371.75,若测定管吸光度为,0.32,，则测定管,Hb,浓度为,Hb,（,g/L,）,=0.32371.75=118.96,Hb,A,50+100+150+200,0.13+0.27+0.41+0.54,6),结果报告,Hb g/L,7),参考值,成年男性：,120-160 g/L,成年女性：,110-150 g/L,新生儿：,170-200 g/L,贫血分级：,轻度：男性,120g/L,女性,110g/L,中度：,90g/L,重点：,60g/L,极重度：,3010,9,/L,，重症黄疸，严重的血管内溶血等。,2,、方法学评价,1,）,HiCN,法,：由国际血液学标准化委员会（,ICSH,）推荐，并经,WHO,确认为血红蛋白测定的参考方法。,优点,：操作简单，结果稳定可靠，试剂容易保存,能测定除,SHb,以外的所有血红蛋白，并易 于建立质控。,缺点,：不能测定,SHb,。,对,HbCO,转化太慢，需要,100,分钟。,高丙种球蛋白血症，变性,Hb,血症，高白细胞的血可出现混浊，按,15g/L,（,pH7.27.5,）甚至,50g/L,（,pH6.76.9,）加入氯化钠可防止，高浓度有核,RBC,引起的混浊不能防止。,KCN,为剧毒，需妥善保存。,2)SDS-Hb,（十二烷基硫酸钠）法,优点,：试剂无毒，结果准确，重复性好,缺点,：,SDS,纯度难保证；,依赖,HiCN,法，间接得到结果；,试剂可破坏,WBC,，不能与,WBC,同时共用标本进行血细胞计数的自动分析。,3,）叠氮高铁血红蛋白法（,HiN,3,）,优点,：准确度、精密度较高,缺点,：试剂仍有毒性，,HbCO,转化慢,本法与,HiCN,法相似,4,）碱羟血红蛋白法（,AHD,575,）,优点,：试剂简易，不含毒性，呈色稳定，准确性与精确性较高。,缺点,:,波峰位于,575nm,处，溶液中碱性较高，不适用于自动检测，,HbF,不能转化。,5,）,CTAB,法,优点,：溶血性强且不破坏白细胞，适于血液分析仪检测。,缺点,：精密度、准确度略低。,沙利法为传统血红蛋白测定法，已淘汰。,6,）血液分析仪法,优点,：简便、快速、多项。,缺点,：仪器型号不同，使用的溶血剂不同，形成的,Hb,衍生物不同。,某些溶血剂形成的,Hb,衍生物稳定性较差，因此要严格控制溶血剂的量及作用时间。,对具有抗溶血剂作用的疾病（肝病、低色素性贫血），溶血不完全而影响结果。,有些溶血剂内虽加入了,KCN,，但其衍生物并非,HiCN,，而是氰化血红蛋白，仪器需经过,HiCN,标准液校正后，才能进行,Hb,测定。,（四）,Hb,与,RBC,测定的临床意义,参考值,RBC Hb,男性 （,4.05.5,）,10,12,/L 120160g/L,女性 （,3.55.0,）,10,12,/L 110150g/L,新生儿 （,6.07.0,）,10,12,/L 170200g/L,70,岁男性,94.2122.2g/L,70,岁女性,86.5111.8g/L,（,1,）生理变化,1,）年龄与性别,新生儿,6,个月,2,岁婴儿 ，生长发育迅速，血容量 造血原料不足，引起生理性贫血。,老年人 ：对营养摄取、利用和造血功能减退，,RBC,、,Hb,比中青年人低。,男性,女性：雄激素,2,）精神因素,：情绪波动，使肾上腺素增多，,RBC,、,Hb,3,）气压,：气压低（高山居民），红细胞代偿性,4,）长期多次,献血,者，红细胞代偿,5,）妊娠期,：妊娠期血容量明显 ，引起血液稀释，,Hb,常在,100g/L,以下，生理性贫血。,（,2,）病理变化,1,）,RBC,和,Hb,增多,指单位容积血液中红细胞数值及血红蛋白含量高于正常值高限。,男性,Hb 170g/L,女性,Hb 160g/L,RBC 6.010,12,/L RBC 5.510,12,/L,相对性增多,：由于大量失水、血浆量下降而使血液浓缩所致，如呕吐、严重腹泻、大面积烧伤等。,绝对性增多,：见于慢性心肺疾病，真性红细胞增多症。,2,）红细胞和,Hb,减少,：贫血,骨髓造血功能低下：如再障、白血病、恶性肿瘤,造血原料缺乏：如缺铁、叶酸、,VB,12,等；,红细胞破坏增加：如各种溶血性贫血；,红细胞丢失过多：如急、慢性失血；,促红细胞生成素减低症（肾性贫血）,Hb,测定与红细胞计数的临床意义相似，但对贫血,程度判断的准确性优于红细胞计数。,Hb,含量与,RBC,数量的关系,红细胞与血红蛋白的增减不一定成比例，如大细胞,性贫血患者的,RBC,往往较,Hb,减少显著；而小细胞性贫血患者则相反。,正色素性贫血：,RBC,、,Hb,成正比减少,低色素性贫血：,RBC Hb,四、红细胞的形态检查,概述,各种原因可作用于红细胞生理进程的不同阶段，从而引起红细胞相应的病理变化，导致某些类型贫血的红细胞发生形态学变化，这些变化包括红细胞的大小、形状、染色性质和内含物的异常，因此,RBC,形态检查常作为追踪贫血线索的一项重要检查内容，对贫血的诊断和鉴别诊断有重要的临床价值。,【,方法及评价,】,1.,显微镜分析法,：是仪器法校准的参考方法；,2.,计算机图像分析,：能快速自动以正常红细胞形态为参考，按红细胞形态特征做出类型和比例统计分析，可用于,RBC,形态变化相关疾病的辅助诊断；,3.,血液分析仪法,：不能直接提供红细胞形态改变的确切信息，需用镜检血涂片核实。,注意：,如果血片制作不良和染色不佳，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。,【,质量控制,】,选择细胞分布均匀的区域：,红细胞堆积棒状穿钱状：细胞过于密集。但如果在血涂片较薄的区域出现，可能是红细胞外附有异型球蛋白,注意完整的检查,顺序。减少人为,因素影响。,人为原因造成红细胞形态异常,1.,涂片不当：出现棘形红细胞、邹缩,RBC,、红细胞缗钱状形成等。,2.,使用非疏水性玻片：口型,RBC,。,3.,染色不当：嗜多色,RBC,。,4.,抗凝剂,EDTA,过高，或长时间放置血液：锯齿状,RBC,。,5.,涂片干燥过慢，或由于固定液中混有少许水分,:,面包圈形,RBC,。,6.,涂片末端附近：长轴方向一致的假椭圆形,RBC,。,（一）正常红细胞形态（染色后）,红细胞直径,6.77.7um,平均直径为,7.2um,。桔红色，向心性淡染，中心苍白，淡染区约为红细胞直径的,1/3,。,意义：正常人、再障、白血病、急性失血可见正常形态。,（二）大小异常,1.,红细胞大小不均（,anisocytosis,）,红细胞直径相差一倍以上，常见于各种重症增,生性贫血，尤其见于重症巨幼细胞贫血。,2.,小红细胞（,microcyte,）,直径小于,6um,者称为小红细胞，正常人偶见。提示血红蛋白合成障碍，可能由于缺铁和珠蛋白代谢异常所致。见于缺铁性贫血和珠蛋白生成障碍性贫血。常伴有中心浅染区扩大。,3.,大红细胞（,macrocyte,）,直径大于,10um,，见于溶血性贫血（由于不全成熟的红细胞增多）及巨幼红细胞性贫血（是由于叶酸或维生素,B12,缺乏，,DNA,合成障碍，血红蛋白合成过剩，脱核后形成大红细胞或巨红细胞）。,红细胞大小不一,2020/11/3,62,红细胞大小不一,2020/11/3,63,4.,巨红细胞（,megalocyte,）,直径大于,15um,，见于巨幼细胞贫血。细胞中心浅,染区消失。,2020/11/3,65,2020/11/3,66,小细胞低色素多（缺铁、地贫）, 单纯小红细胞,microcyte,megalocyte,溶贫、急性失血、巨幼贫,Macrocyte,巨幼贫,anisocytosis,低色素性贫血、溶贫、失贫、巨幼贫等增生性贫血。,2020/11/3,67,（三）形态异常,1.,球形红细胞（,spherocyte,）,球形红细胞直径小于正常，厚度增加常大于,2um,，无中心浅染区，似球形。常见于遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病及红细胞酶缺陷所致溶血性贫血等。,2.,椭圆形红细胞（,elliptocyte,）,椭圆形红细胞呈卵圆形、杆形，长度可大于宽度,3-4,倍，是细胞膜缺陷所致，在遗传形椭圆形红细胞增多症病人血涂片中此细胞可在,25%,以上。,3.,靶形红细胞（,target cell,）,中心区和细胞周缘染色深，其间为不染色的苍白环。是由于,H b,含量不足而且分布不均。见于低色素性贫血，尤其是珠蛋白生成障碍性贫血。,4.,棘形红细胞（,acanthocyte,）,红细胞表面有刺状突起，大小不一、形态各异。,常见于遗传性,脂蛋白缺乏症及脾切除、酒精中毒性肝病、尿毒症。,5.,镰形红细胞（,sickle cell,）,红细胞形如镰刀状，由于红细胞内存在,HbS,所致。主要见于镰形红细胞性贫血。,6.,口形红细胞（,stomatocyte,）,红细胞中心苍白区呈扁平状，形如一个微张开的鱼口。,DIC,及酒精中毒时可见少量此类细胞。,7.,裂片细胞（,schistocyte,）,为红细胞破坏后的碎片，大小不一，形态各异，边缘不规则。在微血管病性溶血性贫血如,DIC,时此类细胞增多。,8.,红细胞形态不齐（,poikilocytosis,）,:,红细胞形态发生多种明显该变，可呈梨形、泪滴形、新月形、三角形等。最常见于巨幼贫。,2020/11/3,76,2020/11/3,77,（四）染色异常,1.,低色素性（,hypochromatic,）红细胞,：血红蛋白含量低，中心浅染区扩大。常见于缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血。,2.,高色素性红细胞（,hyperchromatic,）：,血红蛋白含量高，染色深，中心浅染区缩小或消失。见于巨幼细胞贫血和遗传性球形红细胞增多症。,（,12,）双相性红细胞,3.,嗜多色性（,polychromatic,）细胞,：属于尚未完全成熟的红细胞，细胞较大，由于胞浆中含有多少不等的嗜碱性物质,RNA,而被染成灰蓝色。见于白血病、溶血性贫血。,hypochromic,hyperchromic,polychromatic,缺铁、,地贫,红细胞呈淡灰兰色或紫色，体,积较正常稍大，属于未完全熟,细胞。,活体染色即网织红细胞,增,多，增生性贫血。,巨幼贫、球红增多症,（五）结构异常,1.,嗜碱性点彩红细胞（,basophilic stippling cell,）,：,指在瑞氏染色下，胞浆内存在嗜碱性黑蓝色颗粒的红细胞，属于未完全成熟红细胞，颗粒大小不一、多少不均。常作为铅中毒诊断筛选指标。,嗜碱性点彩红细胞,2020/11/3,84,2.,染色质小体（,Howell-Jolly body,）：,位于成熟或幼红细胞的胞浆中圆形，,1-2um,，紫色，为核残余物，常见于巨幼细胞贫血、溶血性贫血等。,3.,卡波氏环（,Cabot ring,）：,在成熟或幼稚红细胞胞质内，呈紫红色线圈状或,8,字形，可能是胞浆中脂蛋白变性，见于巨幼细胞性贫血和铅中毒。,2020/11/3,87,4.,有核红细胞（,nucleated erythrocyte,）：,即幼稚红细胞，出现在外周血为病理现象，见于各种溶血性贫血、白血病。,有核红细胞,2020/11/3,89,（六）寄生虫：疟原虫、微丝蚴、杜利什曼原虫感染时可见红细胞质内相应病原体。,2020/11/3,90,2020/11/3,91,Thank You,世界触手可及,携手共进，齐创精品工程,