精减9分子生物学技术简介08硕

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 分子生物学技术简介,1,核酸纯化技术与电泳技术,PCR,技术,分子杂交与印迹技术,基因靶向技术,Contents,2,一、核酸纯化技术,-DNA,纯化,1.,核酸混合物成分,:,结构类,-,细胞碎片，细胞器，其他,大分子,-,DNA,，,RNA,，,Protein,，,糖类，脂类等,小分子,-,氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无机物等,2.,关键,:,DNA,，,RNAProtein,3.,方案：,Protein,变性,苯酚：强变性,25,氯仿：弱变性,24,异戊醇：消泡,1,酚氯仿抽提法,3,4.,苯酚的处理：重蒸,-,饱和,-pH,重蒸：去除醌类氧化物,饱和：防止核酸损耗,pH,：,pH7.0-8.0-,核酸最适合,方法：蒸馏,（,183,）,-,收集（棕色瓶）,-,饱和与调,pH,（,Tris-HCl,pH8.0,）,-0.1% 8-,羟基喹啉,- 4 ,或,-20 ,保存,一、核酸纯化技术,-DNA,纯化,4,方法,样品,+,等体积饱和苯酚,10kb,以上轻柔混匀；,10kb,以下振荡,离心,（,12000*g,）,取上清,5,核酸相,Protein,变性相,有机相,6,电泳影响因素,1. DNA,物理性质,质粒：,CC,L,OC,线形：长度与泳动速度成负相关,2.,介质性质,分离范围：,agrose,：,100bp-60kb,PAGE,：,5-500bp,3.,电压：,5v/cm,4.,缓冲液：,TAE,，,TBE,，,TPE,Tris,碱,三羟甲基氨基甲烷,7,不同二级结构形态及其电泳速度,Linear DNA,.,L,Open Circle DNA,OC relexed form,Supercoiled circle,Covalent Closed Circle,CCC,点样孔,8,核酸定量的原理,核酸的紫外吸收,嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在,240-290nm,的紫外波段有一强烈吸收峰，最大吸收值在,260nm,附近。,纯核酸能用此法定量测定含量，但不纯样品不能用此法作定量检测。,琼脂糖凝胶电泳分离出区带，用,EB,染色后在紫外灯下粗略估计含量。,9,核酸定量的原理,双螺旋,DNA,：,1OD,260,=50ug/ml,单链,DNA/RNA,：,1OD,260,=40ug/ml,oligonucleotide,：,1OD,260,= 20,g/ml,纯度：,OD,260,/OD,280,=1.8-2.0,小于,1.8,，表明有蛋白质污染,大于,2.0,，表明有,RNA,污染。,10,配,10,M,的引物贮液,加多少,L,ddH,2,O,Double-distilled,11,核酸纯化技术与电泳技术,PCR,技术,分子杂交与印迹技术,基因靶向技术,Contents,12,二、,PCR,技术,PCR(polymerase,chain reaction),即聚合酶链反应技术，,是指利用耐热,DNA,聚合酶的反复作用，通过变性,-,延伸,-,复性的循环操作，在体外迅速将,DNA,模板扩增数百万倍的一种操作技术。,理论上可在,2,小时内将一个,DNA,分子扩增到,10,6,-10,9,倍，,从而大大提高了对其进行分析研究的速度。,13,PCR,技术与,Nobel Prize,Kary B. Mullis,Michael Smith,14,Polymerase Chain Reaction-a copying machine for DNA molecules,DNA molecules can be mass-produced from,incredibly,small amounts of material with PCR.,Mullis discovery allows the chemist to,mimic,the cells own natural DNA replication process in a test tube. It has now become much easier to,characterise,and compare the genetic material from different individuals and organisms.,15,From a drop,of blood,Extracted DNA,About 95,the ds,are separated,About 55,the primers,bind to the strands,at the correct positions,About 72,the DNA polymerase which is added builds up two new complete copies of the DNA strands,By cycling through the three temperatures the strands are separated and built up again.,16,PCR,反应系统的组成,PCR,反应系统应包括：,1,耐热,DNA,聚合酶（,Taq,酶）,：这是由耐热细菌体内提取的一种,DNA,聚合酶，可保证在,95,，,30,分钟以上不会变性失活。,2,模板,DNA(template,),：,即待分析的目的,DNA,。,3,两种引物,(,primers),：,为了保证,DNA,聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板,DNA,链的,3-,端。,17,4,四种脱氧核糖核苷酸,(,dNTP,),：,用作底物的,dNTP,S,。,5,缓冲溶液（,buffer,）：,保证,DNA,聚合酶催化时所需的适当的溶液,pH,值。,18,PCR,的反应原理,PCR,反应时，一般采用,变性,-,复性,-,延伸,三步循环，也可采用,变性,-,延伸,两步循环。,1,变性：,通常采用加热变性，即将模板,DNA,或延伸后的双链,DNA,加热到,95,0,C,，,使双螺旋,DNA,解开成为单链。,19,2,复性：,通过降低反应温度至,55,0,C,，,使两种引物能与两条解开的,DNA,互补链的,3,端粘合，以提供,DNA,聚合酶催化聚合所需的,3-OH,。,3,延伸：,将反应温度提高到约,70,0,C,，,在耐热,DNA,聚合酶的催化下，根据模板,DNA,提供的碱基顺序，合成两条互补链，从而使模板,DNA,扩增一倍。,按照上述步骤重复操作约,30,次，即可将模板,DNA,扩增数百万倍。,20,Cycle#1,Cycle#2,Cycle#3,flashfilm,21,PCR,的主要用途,（一）目的基因的克隆：, 利用特异性引物以,cDNA,或基因组,DNA,为模板，获得已知的目的基因；, 利用简并引物从,cDNA,文库或基因组文库中获得具有同源性的,DNA,片段；, 利用随机引物从,cDNA,文库或基因组文库中随机获得目的基因。,22,（二）基因的体外突变：,采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。,（三）,DNA,的微量分析：,由于,PCR,技术具有高度敏感性，故可用于微量,DNA,的分析检测。,23,核酸纯化技术与电泳技术,PCR,技术,分子杂交与印迹技术,基因靶向技术,Contents,24,（一）分子杂交：,不同来源的单链核酸（,DNA,或,RNA,），,只要它们具有,大致相同的碱基序列,，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为,分子杂交,（,molecular hybridization,）,。,利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组,DNA,分子中的同源基因或同源序列,。,三、分子杂交与印渍技术,25,（二）印迹技术：,首先由,Edwen,Southern,在,1975,年提出,。,其基本操作过程是：将,DNA,片段在琼脂糖凝胶中,电泳分离,后，置,NaOH,液中浸泡，从而将凝胶中的,DNA,变性,为单链；然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链,DNA,从凝胶中,转移,到硝酸纤维素膜上，再将膜置,80,烘干并使单链,DNA,分子,固定,在膜上，再用于分子,杂交,分析。,用于,DNA,印渍的技术又称为,Southern Blotting,或,Southern,杂交。,26,Southern Blotting,27,酶标记的探针杂交,显色,不同内切酶切基因组,DNA,变性、转移至硝酸纤维素膜上,酶切后的基因组,DNA,电泳,28,（三）探针技术：,将已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素、酶或荧光染料进行标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。,29,印迹技术的类别及应用,（一）,DNA,印迹技术：,又称,Southern,杂交，,即,DNA-DNA,杂交分析,。,（,二）,RNA,印迹技术：,又称,Northern,杂交，即,RNA-DNA,杂交分析,。,（三）蛋白质印迹技术：,又称,Western,杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原,-,抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。,（四）,Eastern,杂交,，,通过,电转移法,将,等电聚焦分离,的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，利用抗原,-,抗体反应，检测转移到膜上特异性蛋白质。,30,*,是,Southern,于,1975,年创建用以鉴定,DNA,中某一特定的基因片段的技术，也称为,Southern,印迹（,Southern Blot,）。,*,通过标记的探针,DNA,与靶,DNA,结合，检测目的基因的存在及大小。,Southern,杂交,31,Northern,杂交,*,也称为,Northern,印迹（,Northern Blot,），用以检测某一特定的,RNA,（通常是,mRNA,）片段的存在及表达量。,*,因与,DNA,的杂交（,Southern,杂交）相对应，故被趣称为,Northern,杂交。,32,Western(,印迹,),杂交,*,蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。,*,与,DNA,、,RNA,水平上的,Southern,杂交、,Northern,杂交相对应，称为,Western,杂交。,*,常结合,Northern,印迹技术，检测基因表达调控。,33,核酸纯化技术与电泳技术,PCR,技术,分子杂交与印迹技术,基因靶向技术,Contents,34,四、基因靶向技术,“基因靶向”技术是指利用细胞脱氧核糖核酸,(,DNA,),可与外源性,DNA,同源序列发生同源重组的性质，定向改造生物某一基因的技术。,Capecchi,Evans,Smithies,2007 Nobel Prize for physiology or medicine,35,四、基因靶向技术,Gene targeting,is a,genetic,technique that uses,homologous recombination,to,change an,endogenous gene.,The method can be used to,delete a gene,remove,exons,and,introduce,point mutations,.,Gene targeting can be permanent or conditional. Conditions can be a specific time during,development / life,of the organism or limitation to a specific,tissue, for,example.,Gene targeting requires the creation of,a specific,vector,for,each gene of interest,. However, it can be used for any gene, regardless of transcriptional activity or gene size.,36,基因敲除,基因敲除（,gene,knock-out,）：利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中,同源序列,进行,同源重组,，把具有功能的同源序列,置换,出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除。,37,38,关于诺贝尔奖,两次获得,NP,的科学家,波兰裔法国女物理学家、化学家居里夫人,发现放射性物质荣获,1903,年诺贝尔物理学奖,发现并提炼出镭和钋,1911,年诺贝尔化学奖,美国物理学家巴丁因,发明世界上第一支晶体管获,1956,年诺贝尔物理学奖,提出超导微观理论获,1972,年诺贝尔物理学奖,美国化学家鲍林,将量子力学应用于化学领域并阐明了化学键的本质获,1954,年化学奖,致力于核武器国际控制并发起反对核实验运动荣获,1962,年和平奖,英国生物化学家桑格,发现胰岛素分子结构获,1958,年诺贝尔化学奖,确定核酸的碱基排列顺序及结构获,1980,年诺贝尔化学奖。,39,获诺贝尔奖的夫妇,获,1903,年诺贝尔物理学奖的法国科学家皮埃尔居里和玛丽居里夫妇。,获,1935,年诺贝尔化学奖的法国科学家约里奥居里夫妇。,获,1947,年诺贝尔生理学和医学奖的科里夫妇。,40,获诺贝尔奖的父子,共同荣获,1915,年诺贝尔物理学奖的布拉格父子,分别荣获,1906,年和,1937,年诺贝尔物理学奖的汤姆逊父子。,分别荣获,1929,年,诺贝尔化学奖,和,1970,年诺贝尔生理学,/,医学奖的奥伊勒父子,分别荣获,1922,年和,1975,年诺贝尔物理学奖的玻尔父子,分别荣获,1924,年和,1981,年诺贝尔物理学奖的西格巴恩父子,分别荣获,1959,年诺贝尔生理,/,医学奖和,2006,年诺贝尔化学奖的科恩伯格父子,41,复习题,Southern blotting,Northern blotting,Western blotting,Gene targeting,Gene knock-out,42,