第九章-凝胶过滤及离子交换层析介质

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 凝胶过滤及离子交换层析介质,凝胶过滤法,又称为分子筛层析、,凝胶层析或排阻层析,是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法,。,凝胶过滤所用的,介质,是由,交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠,。,凝胶珠的内部是多孔的网状结构。,单个凝胶珠本身象“筛子”,不同类型凝胶的筛孔的大小不同。,凝胶过滤示意图,凝胶过滤法,的工作原理,凝胶过滤层析过程示意图,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,凝胶基质,凝胶珠,带网孔的葡聚糖珠,凝胶过滤的基本原理：,含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后，,较大的分子,不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部，,较小的分子,可以通过部分孔道，,更小的分子,可通过任意孔道扩散进入珠体内部。从而使得,小分子移动最慢,中等分子次之,，不同分子尺寸的分子先后顺序不同流出层析柱，达到分离的目的。,1,、常见凝胶种类：,（,1,）葡聚糖凝胶：,商品名称为,Sephadex,。市售有,Sephadex,G10-G200,。,G,后的数字为凝胶吸水值的,10,倍。,G,反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。,（,2,）琼脂糖凝胶：,商品名称为,Sepharose,或,Bio-Gel A,，琼脂糖是从琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点是孔径大，排阻极限高。,Sepharose,2,B,4B,6B,。,（,3,）聚丙烯酰胺凝胶,(,商品名称为,Bio-gel P),：,Sephacryl,S100,S200,S300,S400,。,一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。,注：（,1,）和（,2,）属于多糖类骨架的介质，（,3,）属于合成大分子骨架的介质。,一、凝胶过滤介质,2,、凝胶介质应具备的条件,介质本身为,惰性物质,，不与溶质、溶剂分子发生任何作用；,应,尽量减少介质内含的带电离子基团,，以减少非特异性吸附，提高蛋白质的收率；,介质内,孔径大小要分布均匀,，即孔径分布较窄；,凝胶,珠粒大小均匀,；,介质要有,良好的物理化学稳定性及较高的机械强度,，易于消毒。,凝胶装置图,色谱峰和分离结果,3,、凝胶过滤的优点,分离条件温和,蛋白质不易变性,收率高,重现性好；,工作范围广,分离分子量的覆盖面大,（几百到数百万）；,设备简单,易于操作,周期短,可连续使用多次,（几百次甚至几千次,）,。,4,、色谱柱的重要参数,(1),柱体积：,柱体积是指凝胶装柱后，,从柱的底板到凝胶沉积表面的体积,。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称“床”体积，常用,Vt,表示。,外水体积：,色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用,Vo,表示。,内水体积：,因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这部分间隙的总和为内水体积，常用,Vi,表示。 不包括固体,支持物的体积（,Vg,）。,支持物的体积（,Vg,）,(2),峰洗脱体积：,指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积,，常用,Ve,表示。,当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为,Ve,。,当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。,当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。,5,、凝胶过滤的用途,脱盐,:,用于无机盐和生物大分子的分离，上样量大,为凝胶体积的,1/4,1/5,流速大于,200cm/h,。,分级分离,:,用于分离分子大小相近的物质，通常为大分子物质的分离。必须采用孔径适当、分离范围与分子大小相适应的凝胶，上样量小，仅为床体积的,5%,10%,。,分子量测定,理论上柱长加长 有利于分离效果的提高， 但实际上却对操作不利。,6,、流动相,用作流动相的溶剂,必须能溶解试样,;,与固定相凝胶性质相似，,能浸润凝胶,。当采用软性凝胶时，溶剂应,能使凝胶溶胀,。,溶剂的粘度要低,，高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果，尤其是具有低扩散系数的高分子量试样。,一定的离子强度,：,1),常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节,2,),用氯化钠作离子剂，疏水作用最小,3,)pH,值不能太低，因为,H,+,会腐蚀不锈钢柱,常用的有四氢呋喃、甲苯、邻二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯、二甲基甲酰胺和水等。,一般来说，生物化学领域常采用水溶性溶剂，称为,凝胶过滤色谱,；,在合成高分子化学领域，常采用有机溶剂，称为,凝胶渗透色谱,。,四氢呋喃,是最常用的流动相，它对样品有,良好的溶解性能和低的黏度,，,并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀,，,因此被优先推荐使用。,凝胶渗透色谱,示差折光检测器,流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。,凝胶过滤色谱,紫外吸收检测器,使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相,。,流速,蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要的因素，一般,在低流速下蛋白质分离是比较理想,。,样品容量,进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的分离度。,样品的浓度范围一般在,0.01%-0.5%,，最好是高浓度、小体积，在一般范围内可以得到好的分离效果，蛋白质的样品体积为柱体积的,1%-3%,比较合适。,7,、凝胶过滤基础,凝胶使用前要首先进行处理。,1,）估计用量,根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的是无水干胶，所以要计算干胶用量：,干胶用量,(,g,),柱床体积,(,ml,)/,凝胶的床体积,(,ml/g,),考虑到损失，故一般凝胶用量再增加,10,20,(,质量分数,),。,2),水中膨化,一般,吸水率较小,的凝胶（型号较小、排阻极限较小的凝胶）,膨化时间较短,，在,20,条件下需,24 h,；,吸水率较大,的凝胶（型号较大、排阻极限较大的凝胶）,膨化时间则较长,。,加热煮沸,则使,膨化时间大大缩短,，一般在,1,5 h,即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意,尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏,。,琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理，多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。,3,）排除凝胶中气泡,膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。,纯化可以反复漂洗,，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。,排除凝胶中的气泡很重要,，,否则会影响分离效果，可以通过,抽气或加热煮沸的方法,排除气泡。,4,）凝胶的保存,凝胶的保存一般是,反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂,。,通常加入,0.02,(,质量分数,),的叠氮化钠，,4,下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥,;,可以将凝胶过滤抽干后浸泡在,50,(,体积分数,),乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至,95,(,体积分数,),乙醇脱水后将凝胶抽干。置于,60,烘箱中烘干，即可装瓶保存。,注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。,8,、凝胶层析的基本操作,1,）层析柱的选择,层析柱大小,主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择,。,层析柱的,长度,对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。,一般柱长度不超过,100cm,，为得到高分辨率，,可以将柱子串联使用,。层析柱的直径和长度比一般在,1:25,1:100,之间。,用于分组分离的凝胶柱，,如,脱盐柱,由于对分辨率要求较低，所以,一般比较短,。,2,）装柱（凝胶层析柱）,a.,除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱,操作温度一致,，装柱过程中温度也要恒定,;,b.,应,调节,有利于装柱的凝胶浆,稀稠度,，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除,;,c.,将,柱子固定在稳定的支架上,，并保证其垂直。,d.,先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，,排出里面的气泡,，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的,15,;,e.,柱颈接上胶浆贮存器，将,胶浆徐徐注入,柱内。注意避免产生气泡,;,f.,柱装好后，停,10min,，然后打开出液口，,排出过量洗脱剂,;,g.,柱内,胶面上部保留,2,3cm,洗脱剂,。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。,流过至少,2,倍柱体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来,;,h.,调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，,得到理想流速,。检查流体静力压，不要超过规定值。如果使用蠕动泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要低于后者,10,。,i.,检查柱装得是否均匀和,V,0,的测定,：,用一个为该凝胶完全排阻的有色大分子物质作样品,进行层析。层析时，若有色区带移动不整齐，说明柱装得不好。此大分子的洗脱体积,(,Ve,),就是该凝胶柱的空体积,(V,0,),。,蓝色葡聚糖,(blue dextran)2000,是平均分子质量为,210,6,Da,并与蓝色染料偶联的一种葡聚糖，通常用它来测,V,0,，对于葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和,6,以上的琼脂糖凝胶均可用,0.2,浓度的蓝色葡聚糖,2000,，它在,265nm,及,630nm,处都有吸收峰。,3,）洗脱液的选择,在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用,，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，,改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用,，所以和其他层析方法相比，,凝胶层析洗脱液的选择不那么严格,。,由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的,pH,值范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，,一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析,。,为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。,4,）加样量,加样要尽量快速、均匀。,加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低,;,加样量的多少要根据具体的实验要求而定,凝胶柱较大，加样量较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。,一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的,1,3,(,质量分数,),左右。,从洗脱峰上看，,如果所要各个组分的,洗脱峰分得很开,，为了提高效率，可以适当,增加加样量,；,如果各个组分的洗脱峰只是,刚好分开或没有完全分开,，则,不能再加大加样量,，甚至要减小加样量。,注意：,样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱,。样品的黏度不能过大，否则会影响分离效果。,可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量,。,5,）洗脱速度,要恒定而且合适,方法：,a.,使用,恒流泵,，,b.,恒压重力洗脱,。,洗脱速度,取决于柱长、凝胶种类、颗粒大小等,。,洗脱速度慢，样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好，但过慢会造成样品扩散,加剧,，,区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间延长。,选择合适的洗脱速度，可以通过预备实验来选择,。,一般凝胶的流速是,2,10 ml,h,，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。,总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要,根据具体的实验要求来选择,。,如果被分离的,样品中各个成分受溶液,pH,的影响,，有时带正电荷，有时带负电荷，可用离子交换层析方法进行分离。,离子交换层析的,固相是离子交换体,，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。,二、,离子交换层析,适用于蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物的分离纯化。生化分离中约,75%,的工艺用离子交换法。,1,、原理,:,根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离。,主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异进行分离。,离子交换树脂通常是,不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团,。含有酸性基团的称为,阳离子交换树脂,，可解离出,H,+,，含有碱性基团的称为,阴离子交换树脂,，可解离出,OH,-,。,阳离子交换基,强酸性，聚苯乙烯树脂,弱酸性，羧甲基纤维素,弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂,阴离子交换基,强碱性，聚苯乙烯树脂,弱碱性，二乙氨乙基纤维素,带有,SO,3,或,COO,基团，通常以,SO,3,Na,或,COO,H,形式出现的叫做,阳离子交换基,；,阳离子交换层析,：,用于带正电荷蛋白质的分离,。,带有,N,（,C,2,H,5,）基团通常以,N,（,C,2,H,5,）,Cl,出现的叫做,阴离子交换基,。,阴离子交换层析：,用于带负电荷蛋白质的分离,。,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与,H,+,发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与,OH,-,发生交换而结合在树脂上。,物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。,+,+,示意图（交换树脂表面）,2,、常用离子交换剂的种类与特性,1.,通用型离子交换树脂功能基,：,适用于水处理，湿法冶金，化学合成及医药工业等用途广泛的离子交换树脂。,2.,生化专用离子交换介质,：,主要用于生化领域，一般是凝胶过滤介质的衍生物，其骨架、粒径、排阻极限等与母体相似。有纤维素类、葡聚糖系、琼脂糖系、聚乙烯醇系等,8,类。,详见教材,P183,184,。,生化用离子交换剂的特点,1,、亲水性及生物相容性：,都,具有亲水性，有很好的生物相容性。,以天然大分子为主，依此特性选用含亲水基团的单体开发合成刚性或半刚性的离子交换剂。,2,、孔结构,：,有,3,种结构：,凝胶孔（,溶胀时孔变大,）；,大孔树脂（,孔在干、湿态都存在,）；,琼脂糖介质的孔（,孔径大小与琼脂糖浓度有关,）。,3,、电荷密度,：,电荷密度要适当。,4,、粒度,：,粒径小，分布均匀则分离效果好。,5,、纯度,：,分工业级，分析级，生物技术级，分子生物级。,3,、全交换容量和工作容量,全交换容量,:,每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量，是一个定值。,工作容量,:,每克干介质或每毫升湿介质在一定的操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量，是一个变值。,4,、离子交换层析的基本操作,（,1,）层析柱,离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般,粗而短，不宜过长,。直径和柱长比一般为,1,：,10,1,：,50,之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。,（,2,）装柱,先把柱内装满起始缓冲液，赶尽气泡并把柱子垂直固定；,将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，,柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面平整，床高距柱顶,2,3cm,为宜；,（,3,）平衡缓冲液,平衡缓冲液指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。,平衡缓冲液的离子强度和,pH,值的选择,首先要保证各个待分离物质（如蛋白质）的稳定。,其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。,一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。,（,4,）,上样,上样时注意样品液的离子强度和,pH,值，,上样量以,柱床体积的,1%-5%(,体积分数,),为宜,，使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好分离效果。,将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶部液面达到近于柱床面时开始加样。,用注射器或细长的玻管,沿柱壁绕环加入酶样,，待样液达一定高度后,再在柱中间小心加样,。,待样品刚好全部进入床内后用足量起始缓冲液流过层析柱，洗出未被吸附的物质,。,（,5,）洗脱缓冲液,一般常用梯度洗脱,方式：改变离子强度和改变,pH,值。,改变离子强度通常是在洗脱过程中,逐步增大离子强度,，使各组分被洗脱下来；,改变,pH,值的洗脱，,阳离子交换剂一般是,pH,值从低到高洗脱,，,阴离子交换剂一般是,pH,值从高到低,。,由于,pH,值可能对蛋白的稳定性有较大影响，故,一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。,(6),洗脱速度,洗脱速度通常要保持恒定,。,洗脱速度慢比快的分辨率要好，但速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，,所以,要根据实际情况选择合适的洗脱速度,。,如果洗脱峰相对集中某个区域造成,重叠,，则应适当,缩小梯度范围,或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。,（,7,）样品的浓缩、脱盐,离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要,浓缩、脱盐,处理。,