解剖小白鼠实验

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞原代培养,(Cell primary culture),1,实验目的,了解细胞体外培养的原理、基本方,法，了解无菌操作方法及注意事项。,学习观察体外培养细胞的形态及生长,状况。,2,实验原理,用直接从机体获得的细胞进行的培养称为,原代培养,。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，,使分散成单个细胞，,然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。,3,消化培养法,又称为,组织消化分散法,：,将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。,4,实验仪器,超净工作台,，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸,CO2,培养箱,倒置显微镜,自动双重纯水蒸馏器，纯水仪,耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器,5,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器，除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,6,滤 器,7,滤器工作原理,8,CO2,培养箱,CO2,培养箱设定的条件为,37 ,，,5,CO2,。,使用,CO2,培养箱应注意的问题：,用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。,保持培养箱内空气干净。定期消毒（,90,，,14 h),。,箱内无菌蒸馏水,3000,毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,9,倒置显微镜,10,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,11,培 养 板,12,培养瓶,13,实验材料,2,月,龄的,小,鼠,14,实验试剂,（,1,）,1640-RPMI,培养液,（,2,）,小牛血清,（,3,）,青、链霉素,（,4,）,PBS,液,（,5,）,5,NaHCO3,（,6,）,75,酒精,15,实验步骤,一、培养前的准备工作,（,1,）,清洗与消毒,（,2,）,配制溶液,（,3,）,紫外线消毒,（,4,） 洗手和着装,（,5,） 进入无菌室,16,实验步骤,动物细胞原代培养过程图,17,方法与步骤,（,1,）动物,拉椎,处死,（,2,）取肝及剪碎：,剖开腹部,，将,肝,脏取出，放入小培养皿中，用,PBS,液洗涤,1,次；将,肝,剪成,1mm,大小的块，再用,PBS,液洗涤,2,次，直到液体澄清。,18,（,3,）消化及分散组织块：,将上述清洗过的组织放入,试,管内，加入的,0.25,胰蛋白酶液，,完全没过组织,，置,37,水浴中消化,20,30min,，每隔,10min,摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出,试,管，吸去胰蛋白酶液，加入,5ml,培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，取上清液至另一,试,管中。,19,（,4,）观察与计数：,从细胞悬液中取出,1,滴滴于载玻片上，显微镜下观察细胞的数目。看到球型的细胞，证明消化下来细胞，实验成功。,20,作业,:,1.,在细胞培养过程中如何防止污染,?,21,22,无菌操作的几个注意事项,1,、操作前要洗手，进入超净台后手要用,75%,酒精或,0.2%,新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。,2,、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。,3,、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。,4,、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。,5,、瓶子开口后要尽量保持,45,斜位。,6,、吸溶液的吸管等不能混用。,23,7,、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。,8,、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。,9,、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。,24,