第三代基因编辑技术CRISPRCas9解析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第三代基因编辑技术,CRISPR/Cas9,专题内容,基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术,可以精确地定位到基因组的某一位点,并剪断靶标,DNA,片段并插入新的基因片段,基因编辑技术,基因编辑工具,锌指核酸内切酶,（,ZFN,）,类转录激活因子效应物核酸酶,（,TALEN,）,成簇、规律间隔短回文重复序列,/CRISPR,相关蛋白,9,Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,（,CRISPR/Cas9,）,基因编辑工具,ZFN,TALEN,CRISPR/Cas,Target,Protein: DNA,Protein: DNA,(gRNA-Cas9): DNA,Structure,Zinc finger DNAbinding motifs in a,configuration,the,-,helixrecognizes 3 bpsegments in DNA,Proteins containingDNA-binding domainsthat recognize specificDNA sequences downto the base pair,20nt crRNA (CRISPR RNA) fused to a tracrRNA and Cas9 endonuclease that recognize specific sequences to the base pair,Feasibility,Difficult:,-Need a customized protein for each gene sequence-Low delivery efficiency,Easy:,- all-in-one gRNA-Cas9 vector system- multi gene editing is feasible,Reference,Beerli,et al,., 1998Perez-Pinera,et al,.,2012Gaj,et al,., 2013,Moscou andBogdanove, 2009Boch,et al,., 2009Gaj,et al,., 2013,Mali,et al,., 2013Cong,et al,., 2013Jiang,et al,., 2015,1987,Ishino,Y,等在,K12,大肠杆菌的碱性磷酸酶 基因附近发现串联间隔重复序列,2005,三个研究小组均发现,CRISPR,的间隔序列,(spacer),与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源,2002,该结构被正式定义为成,簇、规律间隔短回文重复序列（,CRISPR,）,2007,Barrangou,等首次发现并证明细菌可能利用,CRSPR,系统对抗噬菌体入侵。,2013,Zhang,研究组首次在人,293T,细胞与小鼠,Nero2A,细胞中利,用,Crispr/Cas9,系统实现了基因定点突变。,Crispr/Cas9,研究历史,II,型,CRISPR,免疫,II,型,CRISPR,免疫,Crispr/Cas9,系统核心：,Cas9,核酸酶、,sgRNA,CRISPR,系统结构,(,间隔相邻基序,),Cas9,切割后的,DNA,修复,编辑效率检测,T7E1 Assays,sgRNA,设计,功能,物种数,最大输入长度（,nt,）,网址,CRISPR Design,设计,/,脱靶效应评估,15,23-500,http:/crispr.mit.edu,ZiFiT,设计,/,脱靶效应评估,9,不限,http:/zifit.partners.org/ZiFiT,Cas9 Design,设计,/,脱靶效应评估,10,不限,Cas-OFFinder,脱靶效应评估,25,15-25, Diseases,Immunodeficiency,Crispr,系统应用,Wenhui Hu,et al,. PNAS.2014,111(31):11461-6,CRISPR/Cas9,基因编辑技术能够有效利用其,sgRNAs,靶向作用于,HIV-1,原病毒,LTR(,长末端重复序列,),区，对,HIV-1,原病毒进行有效清除。在感染,HIV-1,的细胞中使用携带,2,个,sgRNAs,CRISPR/Cas9,系统可以明显抑制病毒复制与再生效率。,Crispr,系统应用,Chen SD ,et al,. Cell. 2015 March 12; 160(6): 12461260,2015,年，,Zhang F,与,Phillip A.,Sharp,团队构建了一个包含,67405,个,sgRNA,的,CRISPR,文库，作用于一个不具有转移能力的肺癌细胞系。将处理后的细胞接种于免疫缺陷小鼠后，小鼠出现了明显的肿瘤转移表型。,建立癌症模型,Crispr,系统应用,体外培养的人类正常肠道成体干细胞中通过,CRISPR/Cas,引入,4,个结肠癌基因突变,(,APC,、,P53,、,KRAS,和,SMAD4,),建立结直肠癌类器官模型,Matano M,et al,. Nat Med, 2015, 21(3):256262.,2015,年，,Brandon,等将,CRISPR,技术应用到了癌症相关的基因治疗研究，采用了慢病毒载体使,CRISPR,系统可以被,Doxycycline,诱导表达，对细胞进行编辑，实现抗凋亡基因,MCL-1,在体内体外的敲除。,Brandon J,et al,.,Cell Rep, 2015, 10(8): 14221432.,Crispr,系统应用,Crispr,系统应用,程序性死亡受体,Programmed death-1(PD-1),主流治疗手段,：,抑制性单克隆抗体药物,临床实验,Sponsor,&,Collaborator,First received,Phase,Biological,Intervention,Metastatic Non-small Cell Lung Cancer,Sichuan University,&,MedGenCell, Co., Ltd.,May,30, 2016,Phase,I,PD-1 Knockout T Cells,Castration Resistant Prostate Cancer,Peking University,&,Cell Biotech Co., Ltd.,August 11, 2016,Phase,I,PD-1 Knockout T Cells,Muscle-invasive Bladder Cancer,Peking University,&,Cell Biotech Co., Ltd.,August,1, 2016,Phase,I,PD-1 Knockout T Cells,Metastatic Renal Cell Carcinoma,Peking University,&,Cell Biotech Co., Ltd.,August 11, 2016,Phase,I,PD-1 Knockout T Cells,新型疗法,嵌合抗原受体,T,细胞（,CAR-T,）,不良反应：,细胞因子释放综合征,基因编辑技术应用在,CAR-T,上的成功案例：,Cellectis,公司,UCART19,新型疗法,UCART19+TALEN,TCR,CD52,RQR8,降低排异反应,使细胞对阿仑单抗耐药，用于,CAR-T,细胞筛选，提高筛选效率和疗效,可增加细胞对利妥昔单抗的敏感性降低副作用率，保证安全性,CRISPR/Cas9,CAR-T,2.0 Ver,CAR-T,&,&,新型疗法,发展机会：,1.,具备,CRISPR,技术储备,2.,临床研究经验丰富,3.,靶点储备丰富,4.,免疫细胞储备,Thanks,！,2016.8.27,