体外培养细胞生长与增殖过程

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,体外培养细胞生长与增殖过程,4.1,概 述,4. 1.1,发展历史,4.1.2 动物细胞的特点,4.1.3 动物细胞与组织培养的概念,4.1.4 动物细胞的体外培养生长特性,4. 1.1,发展历史,1,、动物细胞（组织）培养技术的起源：,19,世纪所应用的胚胎学技术。,动物细胞培养的奠基人：美国生物学家哈里森,（,1907,年）用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将,蛙胚神经组织培养在淋巴液中，存活几周，有细,胞突起的生长过程。,先驱者中法国学者卡勒尔：设计卡氏培养瓶自,1923,年用于培养鸡胚的心肌组织成功以后，已使,多种动物组织培养获得成功。,4. 1.1,发展历史,2,、,20,世纪,40,年代以后：,动物组织培养的科学家们研究重点集中在培养,基方面。,3,、,20,世纪,80,年代以后：,随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发,展，已能把特定的外源基因通过,PCR,技术扩增几,千倍，并可转染到细胞内，使其得到高质量的表,达。,4. 1.1,发展历史,4,、近年：,淋巴细胞杂交瘤技术，使动物细胞培养进入了,一个新领域。杂交瘤细胞能在体外悬浮情况下大,量繁殖并产生单克隆抗体。,随着基因重组和单克隆抗体技术的发展，动物,细胞组织培养展现出越来越可观的工业化前景。,4.1.2 动物细胞的特点,（一）动物细胞之间的连接特点：,1.,紧密连接：牢固、无间隙。,2.,间隙连接：,2-3nm,间隙。,3.,隔壁连接：,20-30nm,间隔，有横隔。,4.,中间连接： 无横隔、透明，间隔,20-30nm,。,5.,桥粒连接： 有间隙，有纤维形成的特殊结构。,4.1.2 动物细胞的特点,（二）动物细胞的培养特点：,1.,动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。,2.,动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染。,3.,培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。,4.,动物细胞间主要以聚集体形式存在。,5.,原代细胞一般繁殖,50,代左右即退化死亡。,4.1.3 动物细胞与组织培养的概念,动物细胞与组织培养：,从动物体内取出,细胞或组织，模拟体内的生理环境条件，,在无菌、适宜温度和丰富营养条件下，使,离体细胞或组织生存、生长并维持结构和,功能的一门技术。,是动物细胞工程的重要技术基础。,贴附和非贴附生长：,1.,贴附型细胞：,细胞间相互接触；细胞与细胞外基,质（培养器皿壁或载体）结合。多数细胞属贴附型细,胞。,2.,非贴附型细胞：,此类细胞体外生长不必贴壁，可,在培养液中悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤,细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。,贴附型细胞,(anchorage-dependent cell),哺乳动物大多数细胞必须附着固体表面生长。当细胞布满表,面（单层）时，即停止生长。若取走一片细胞 ，存留的细胞就,会沿着表面生长而重新布满表面。从生长表面脱落而进入液体,的细胞通常不再生长而逐渐退化。（为单层附壁培养）,按培养细胞的形态，可分四类：,1.,成纤维型细胞,(fibroblast),外形与体内成纤维细胞相似，梭形或不规则形。,细胞贴壁后呈梭形，胞质外伸出,2-3,个长短不同的突起，成,放射状，胞间疏松。,起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这种形式。,贴附型细胞,2.,上皮型细胞,(epithelium),：,泛指形状上类似上皮细胞的细胞。特点：扁平状，,形态较为规则。胞间紧密，单层贴壁。起源于内、外,胚层的细胞体外培养时如此。,3.,游走型细胞,(wandering),：,类似巨噬细胞样的特征。外形不规则。,分散生长，不连接成片，成群落；通常伸出伪足和,突起，贴壁位置不固定，呈活跃的游走和变形运动。,单核巨噬细胞系细胞体外培养常如此：颗粒性白细,胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞。,贴附型细胞,4.,多形型细胞,( polymorphic),：,形态上不规则（难以确定其形态）的细胞。,细胞胞体略呈多角形；细胞胞突细长形；类,似丝状伪足。,如神经元和神经胶质细胞,影响细胞形态的主要因素,细胞的来源不同；,生理条件不同，功能状态不同；,血清成分、培养基成分、 添加成分、培养基的酸碱,度、气象环境、温度等不同。,如,HeLa,细胞原本是一种上皮型癌细胞，但若在过酸,或过碱的条件下培养，可以呈现梭形，当酸碱适中时,又可以恢复上皮型特征。,非贴附型细胞或悬浮型细胞,（,suspend cell,）,此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中,悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤细胞,和杂交瘤细胞以及转化细胞系等。,形态：,始终为球状,优点：,细胞密度高，培养效率高，易操作控,制，便于大规模生长。,有些细胞既可悬浮，也可以贴附。,4.1.,5,体外培养细胞的生长特性,1,、 贴附：,细胞接种后很快形成伪足，与底物点接触，细,胞逐渐呈放射状伸展，细胞体中心变扁平状。,影响因素：低钙不利于细胞伸展；低温和培养,液流动过快妨碍贴附；生物因素：表皮生长因子,（刺激神经胶质细胞的皱褶活动）、成纤维细胞生,长因子（减少,3T3,细胞的扁平度）。,4.1.,5,体外培养细胞的生长特性,2,、接触抑制（,contact inhibition,）：,正常细胞移动、靠近而接触时，细胞不再移动且,停止接触区质膜的皱褶活动和细胞运动以及细胞的,重叠生长。肿瘤（癌）细胞无此现象。,3,、密度抑制（,density inhibition,）：,只要营养充分，接触抑制的细胞仍能分裂增殖。,但细胞密度进一步加大、营养减少、代谢产物增多,时，（因营养和代谢物的影响）细胞分裂停止，出,现接触抑制。,4.1.,6,体外培养细胞的生长与增殖过程,、细胞系的生长过程：,培养的细胞持续生长的时间有限，最终自行停止生,长。细胞的种类、性状、原供体的年龄决定其生存时,间长短。,如：人胚成纤维细胞存活一年、传,3050,代相当于,150300,个细胞周期）；供体是成体或衰老个体时则,存活更短；肝、肾细胞仅能传几代或十几代。,获永生性或恶性转化（遗传性改变）生存期则发生,变化。,4.1.,6.1,细胞系的生长过程：,1,、原代培养期（,primary culture phage),：,从取出,体内组织接种培养到第一次传代的时期。,14,周。,细胞：移动活跃、分裂但不旺盛、相似于（也能,代表）体内组织、药物测试的好对象。,2,、传代期（,passage phase,）：,原代细胞生长一,定时间后，将其分开接种到多个培养瓶中继续培养的,过程称传代。,细胞系（,cell line,）：,传代细胞分裂增殖旺盛、能,保持一致的二倍体核型，称细胞系。细胞的代数,=,转,接的次数。每一代中细胞分裂,36,次。,4.1.,6.1,细胞系的生长过程：,3,、衰亡期（,senescence phase,）：,细胞仍生存，但,不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。 细胞可发生自发,转化，其标志之一：获永久增殖能力而成连续细胞系,（株）。连续细胞系（株）：主要发生在传代期。,细胞系（,cell line,）：,第一次传代培养后的细胞。,细胞株（,cell strain,）：,在经过生物学鉴定的细胞系,中，通过单细胞培养或筛选法，由单细胞增殖形成的,细胞群。,亚株（,substrain,）：？,体 外 培 养 细 胞 系 的 生 长 曲 线,0 2 4 6 8 10 12 14 16 18,t,周,接种培养,第一次传代,衰老,死亡,传 代 期,细 胞 系,连续细胞系,原代,培养,转化,传代间隔,细 胞 浓 度 的 指 数,4.1.,6.2,每代（群体）细胞的生长过程,每代细胞要经过四个生长阶段：,1,、潜伏期,（,latent phase,）,：,接种,悬浮,贴附,不马上分裂（潜伏）。,原（初）代培养细胞：,2496 h,；传代和肿瘤细胞：,624 h,。,2,、对数生长期,（,logarthmic growth phase,）,：,分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛程,度）。,细胞分裂指数（,mitotic index, MI,）,:,MI=(,分裂相个数,1000,个细胞,) 100%,。初代,MI,低，传代和肿瘤细胞系,MI,高达,35%,。,4.1.,6.2,每代（群体）细胞的生长过程,在理想的环境下，细胞处于较恒定的生长分裂状,况，其生长速率：,d,N,d,t,N,（,N,时间,t,时的细胞个数；,细胞比生长速率：在对数生,长期，群体细胞数增殖一倍所需要的时间，以时间,T,表示）,积分得：,T,2 ,(,时间,T,表示细胞比生长,速率,),此时期细胞以指数形式增长繁殖。持续,35,天。,4.1.,6.2,每代（群体）细胞的生长过程,3,、稳定期（,stationary phase,）：,因培养空间和营,养物质有限，特别是代谢废物的累积，细胞进入：新,分裂的细胞数与死亡的细胞数相等的动态平衡时期。,细胞数不增加，但代谢还是活跃的。,4,、衰亡期（,senescence,）：,营养物的耗尽和有害,物质的作用，细胞死亡数大于细胞分裂数。,最高分裂次数限制：正常细胞都有，肿瘤（癌）细,胞没有。,细胞浓度的对数,潜伏期,对数生长期,稳定期,衰亡期,0 24 48 72 96 120 h,每代（群体）细胞生长的四个时期,4.2 动物细胞与组织培养的基本技术,4.2.1 体外培养的特点,4.2.2 培养条件和工具,4.2.3 原代培养和传代培养技术,4.2.4 贴壁培养技术,4.2.5 动物细胞培养的传统方法,4.2.6,动物细胞大规模培养技术,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,4.2.,8,动物细胞培养的现状与展望,4.2.1 体外培养的特点,1,、动物细胞营养需求苛刻：,氨基酸（细胞是不能自,主合成必须氨基酸的）、单糖（能源；合成某些氨基,酸、脂肪、核酸的原料）、维生素（辅酶、辅基）、,其他大量和微量元素、促生长因子和激素（促进细胞,生长、维持细胞功能、保持细胞分化和未分化状态）,2,、培养环境条件要求严格：,温度、渗透压（多数,哺乳动物细胞,260320mOsm,kg,）、,pH,（及溶氧量,CO,2,和,HO,-,）的相对恒定、剪切力等。,3,、易污染、防污染：,细菌、真菌、病毒；血清和,组织材料。,4.2.2 培养条件和工具,一、培养条件：,1.,温度：,2. pH,：,3.,气体：,4.,营养：,二、培养工具：,1.,器皿：,2.,载体：,4.2.2 培养条件和工具,一、培养条件：,1,、温度：,多数哺乳动物,37,，偏离则影响代谢和,生长。高温对细胞的威胁更大。,2,、,pH,：,最适，低于,6,、高于影响生长甚,至死亡。,3,、气体：,容器空间中,O,2,和,CO,2,细胞代谢的进行。,O,2,？,CO,2,？,CO,2,培养箱？,4,、营养：,需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌,呤、嘧啶、激素和生长因子。,4.2.2 培养条件,培养基,1.,天然培养基（,natural medium,）：,来自动物体液,或组织分离提取的培养基。,种类：生物性液体（如血清）、组织浸液（如胚胎,浸液）、凝固剂（如血浆）等。,（,1,）血清：,主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、,马、鸡、兔、羊、人血清。各有特点。含各种血浆蛋,白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生长因子及无,机物等，在生理平衡下促进或抑制细胞生长。成分复,杂，不同 种类、不同厂家、不同批号作用有有差异。,4.2.2 培养条件,天然培养基,血清提供细胞生存、生长和增殖必须的激素与生长,因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素（雌二,醇、孕酮、睾酮）、成纤维细胞生长因子（,FGF,）、,表皮生长因子（,EGF,）、血小板生长因子（,PDGF,）,（,2,） 鼠尾胶原及其他胶原：,细胞附着、生长的,基质，利于组织（特别是上皮类）细胞的固定。,（,3,）鸡胚浸出液：,含生长因子、核蛋白、氨基,酸等，刺激细胞生长。,（,4,）水解乳蛋白：,氨基酸含量高。用于原代和,细胞系的培养。,4.2.2 培养条件,培养基,2,、合成培养基,（,synthetic medium,）,：,给细胞提供近,似体内的生理环境，且便于控制和标准化。但不是完,全培养基，只能维持细胞不死而不能促进细胞分裂。,使用时需加天然培养基。,（,1,）基本培养基（,essential medium,）：,人工合成,的只能使体外培养细胞短暂生存（添加天然培养基后,细胞才能繁殖）的培养基。也称通用培养基（可用于,许多细胞）。低限量基础培养基主要含：无机盐、微,量元素、氨基酸、维生素、碳水化合物等。现已有几,十种，用途不同。,4.2.2 培养条件,培养基,2,、合成培养基：,（,2,）无血清培养基（,serun free medium,SFM,）,：,化学限定性培养基或化学成分明确培养基（,chemical,defined medium),。不需添加血清就可维持体外细胞,较长时间生长繁殖的合成培养基。在基础理论研究中,血清的使用影响实验结果（原因与结果难以对应）。,包括两部分：,基础培养液：合成培养液，如,HamF,12,和,DMEM,以及许多已商品化的基础培养液，,SEM,用于角质细,胞,SFM,用于淋巴细胞，等等。,4.2.2 培养条件,培养基,无血清培养基的添加成分：,（,1,）细胞外基质,（,extracellular matrix,ECM,）：,促进贴壁。如纤连蛋白（,FN,），层粘连蛋白（,LN,）,等。,FN,促进中胚层源细胞的贴壁和分化；,LN,作用于,内皮细胞和内胚层源细胞。,（,2,）促生长因子与激素：,（,3,）酶抑制剂：,如大豆胰酶抑制剂。（胰酶消化,传代）,（,4,）结合蛋白和转运蛋白：,如转铁蛋白、牛血清,蛋白，增加黏度，免受机械损伤。,4.2.3 原代培养与传代培养技术,4.2.3.1,原代培养,1,、组织块培养,处死动物，无菌取组织块入小烧杯中，用尖嘴眼,科剪刀将组织块剪碎，吸管吸取,Hanks,液冲下剪刀上,的碎片，补加,3-5mLHanks,液，用吸管轻轻吹打，低,速离心，弃去上清液，留下组织块。,2,、组织消化培养,（,1,）取材、分离、消化,消化软组织：,0.25%,胰蛋白酶,消化纤维组织：胶原酶,消化传代细胞（制成细胞悬液）：,EDTA+,胰蛋白酶,.1,原代培养,2,、培养：,接种：接种量大小视情况而定；防污染；常规检,查：,1-2,天做一次。,4.2.3.2,传代培养：,原代细胞分裂增殖成片，布满器皿表面时，则需,对其分离进行重新培养。,传代技术的关键：,1,、传代时机：,80-90%,汇合时最好（过早：细胞,产量不足 过晚：细胞健康不佳）。,2.,酶消化的方法和细胞对酶的反应：,敏感,/,迟钝,（酶作用时间和方法，细胞的类型和来源）,4.2.4 贴壁培养技术,4.2.4.1,贴壁培养的材料：,贴壁培养：细胞贴附在一定的固相表面进行培养。,（,1,）玻璃：明矾,硅硼胶玻璃。,（,2,）塑料：聚苯乙烯。,（,3,）金属：不锈钢和肽。,（,4,）微载体：天然葡聚糖和其他天然或合成聚合物,4.2.4.2,贴壁培养的生长特性,1,、游离期：,接种的细胞，悬浮，细质回缩变圆。,2,、吸附期：,细胞类型不同，贴壁时间有差异。贴壁,快：单个细胞，传代细胞；贴壁慢：组织快，较大细,胞团；不利于细胞贴壁的：细胞状态不好，培养基,pH,不正常，培养瓶不洁。,3,、繁殖期：,圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞，,此时有细胞运动，无细胞分裂。经一段停滞，开始分,裂。随着细胞数量的增多，开始接触并连接成片，这,时期细胞分裂及运动停止。,4,、退化期：,细胞长满培养瓶壁达一定密度，随着营,养物的消耗和代谢物的积累，细胞开始退化。,4.2.5 动物细胞培养的传统方法,悬滴培养法,旋转管培养法,灌注小室培养法,培养瓶培养法,培养板培养法,4.2.5.1,悬滴培养法,悬滴培养法：将组织器官植块接种于一盖玻片上，,加一滴培养液，翻转盖玻片（植块和培养液悬挂）放,置于凹形哉玻片上，熔蜡密封入培养箱培养。是最早,的传统技术（,1907,年,Harrison,创立）。,悬滴培养法示意图,4.2.5.2,旋转管培养法,旋转管培养法：,19331934,年,Gey,和,Lewis,建立管,状培养器皿固定于旋转装置上旋转， 培养物接种于器,皿 中培养。,优点：,培养物交替地接触培养液和气体环境利于细,胞组织生长。,缺点：,旋转管不易在显微镜下观察。可将培养物,接种在载玻片上，再入旋转管培养，取载玻片观察。,4.2.5.3,灌注小室培养法,灌注小室培养法：,最初由,Burrows,（,1912,年）设,计。载玻片,上下 壁，金属圈,侧壁，密封成小,室，其侧面有液体流入和流出口。,特点：,液体可循环供应。,后来的许多大规模培养系统在设计上都参考了此,方法的原理。,4.2.5.4,培养瓶培养法,培养瓶培养法：,培养物直接接种在培养瓶内，在放,入培养箱培养。最早采用的是,Carrel,（,1923,年）设计,的卡氏瓶。,与此相关的方法：,载玻片加培养瓶法。优点：避免,培养瓶表面粗糙对培养物的影响；方便染色观察和永,久保存；增加了培养面积。,4.2.5.5,培养板培养法,培养板培养法：,将培养物接种在培养板的孔内，,放入,CO,2,培养箱内培养。曾叫微量培养法，是最常用,的体外培养技术方法。,常用的（一次性的）培养板：,6,孔、,24,孔、,96,孔,（,96,孔最常用）。,4.2.6,动物细胞大规模培养技术,在贴壁和悬浮培养发基础基础上，融合固定化,细胞、流式细胞术、填充床、生物反应器和人工灌,流等技术而发展起了动物细胞大规模培养技术。包,括悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中空纤维,法、微多孔载体培养等。,4.2.6.1,悬浮培养技术,少数动物细胞属于悬浮生长型，离体培养时,不需附着物，只需悬浮于培养液中就可以良好,生长。,动物活体组织分散、过滤、离心、纯化、漂,洗，接种到适宜培养液中，于特定培养条件下,培养。,酶消化形成,分散细胞,加培养液终止,消化吹打分散,形成分散细胞,剪切成细快,酶消化、吹打分散,形成细胞悬浮液,逐级稀释,细胞悬浮液制备过程示意图,4.2.6.2,微载体培养技术,最初在培养液中加小滚瓶增加贴壁细胞的生长面,积，此法构造简单，成本低，重复性好，简单易行。,但：劳动强度大、滚瓶空间大而提供的面积有限、细,胞产率低、监控不便。,微载体系统培养贴壁细胞技术,(Van Wezel,1967):,一定程度上改变了其不足、最初的载体为离子交换树,脂微珠（,60250,微米）。后经改进，选带不同基团的,葡聚糖交联成几种大分子（带适当电荷）作微载体，,利于细胞的贴壁生长。,4.2.6.2,微载体培养技术,细胞支持物（微载体基质）,应具备的特征：,1.,生物相容性；,2.,简便的无毒害固定化,3.,良好的传质特性；,4.,良好的机械稳定性；,5.,最大的比表面积、,6.,适合细胞生长的形状和小；,7.,粒径分布均一；,8.,能高压灭菌；,9.,可重复利用，易于清洗；,10.,保护细胞免受机械损伤；,11.,接种方便；,12.,能固定大部分细胞；,13.,适合大规模细胞培养；,14.,细胞载体培养基易分离；,15.,适于贴壁和悬浮培养；,4.2.6.3,微囊化培养技术,将细胞包裹在微囊中进行悬浮培养。微囊是一种人,造半透膜制成的微球体，小分子 物质可自由穿过，,酶、辅酶、离子交换剂、活性碳、蛋白质包裹在其中,不能逸出，催化反应底物。,20,世纪,80,年代初（,Lim,和,Sum,）制成了细胞能在其,中生长的微囊。微囊材料：海藻酸（,1,4-,键连接的多,聚甘露糖醛酸和古罗糖醛酸）、多聚赖氨酸。,4.2.6.4,中空纤维法,中空纤维法：,1972,年（,Richard Kncazek,）发明。,最初由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的半透膜，,表面有许多海绵状多孔结构，构成动物细胞生存的立,体三维空间（类似于毛细血管）。,36,层空心纤维构成培养系统，细胞接种于空心纤,维的外腔。分离纯化细胞分泌物极其方便。,现在已开发出硅胶、聚砜、聚丙烯等的空心纤维。,4.2.6.5,微多孔载体培养技术,传统实心微载体的不足：只能固定贴壁细胞、后期,细胞老化而脱落、贴壁需血清中的因子帮助。,微多孔载体培养：克服了其不足。载体内部有网状,结构的小孔供细胞生长、增加细胞的固定化和稳定,化，可用于大规模高密度培养动物细胞。,优点：降低血清用量、易固定化、比表面积大、细,胞免受机械损伤、适合于悬浮细胞的固定化连续灌流,培养、也适合于大规模高密度培养系统。,4.2.6.5,微多孔载体培养技术,微多孔载体的制作材料：生物相容性（无毒、黏,附细胞）、机械稳定性（保证长期搅拌不破粹和清洗,处理回收利用）、热稳定性（高温高压灭菌不分解、,不破粹、不软化）要好。,制备：,1.,成球材料和临时性成孔材料分散于介质,中液滴，,2.,液滴固化成小球，,3.,去除（如高温烧结）,临时性成孔材料，形成多孔微球，,4.,后期处理,表,面处理、清洗、灭菌等。,多孔微载体的制备,成球材料,分散,介质,成 球,成孔,去除球中的成孔物质,后期处理,多孔微载体,4.2.6.5,微多孔载体的制备方法,材料不同、制备方法不同。,1.,高温烧结法：玻璃、陶瓷等。,高岭土、云母（成孔材料）、矾土、氢氧化铝、,二氧化硅 碾细混匀，加甲基醋酸纤维素 浆液,挤压球状颗粒干燥,1000,烧结几小时陶,瓷小颗粒,1400 ,熔化云母多孔陶瓷载体。,4.2.6.5,微多孔载体的制备方法,2.,高分子材料成球聚和法：,水（悬浮分散介质）加分散剂，强力搅拌不溶,于水的单体分散成小液珠加引发剂（油溶性） 成,珠状小球,100105 ,去除未反应的单体和成孔物质,稀酸清洗夹在微球中的分散剂多孔微球氧化剂,处理使其表面极化亲水的多孔载体。,2.4.6.5,微多孔载体的制备方法,3.,聚合物快速凝聚法：,海藻酸钠溶液在氯化钙溶液,中快速凝聚成球。,4.,锐孔喷液冷冻凝固法：,成球材料溶于水溶液锐,孔喷射成小液滴低温疏水性物质中遇冷凝固,含冰晶的固体小球物理化学方法固化成球材料,去除小球中的冰晶，成多孔性小球。,4.2.6.5,微多孔载体的制备方法,5.,油浴复相乳液分离法：,油溶性成孔材料,K,剧烈搅拌,乳化分散到成球材料,P,的水溶液中水包油型小液滴,在分散到油性物质,O,中复相油滴溶剂,N,（与水混,溶但不溶解,P,）吸出液滴中的水分硬化成固体小球,加热、减压、溶剂萃取、冰冻干燥等去除成孔材料,多孔微球。,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,一、生物反应器：,传统的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量,培养。因为动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切,敏感、对培养环境要求严格。,20,世纪,70,年代以来，细胞培养用反应器种类越来,越多，规模越来越大。但其结构形式仍以搅拌式、气,升式、固定床为主。,国外，气升式反应器已放大到,5 00010 000L,，搅,拌式反应器达到,8 000L,。,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,二、应用：,1962,年以后，动物细胞培养规模开始扩大，如今,已成为生物、医学研究和应用领域广泛采用的技术方,法。,利用动物细胞培养生产生物活性物质具有独特的,作用和意义，也是植物、微生物细胞培养所无法替代,的。,动物细胞的内环境与植物微生物细胞全然不同。,动物细胞能精确地转录、翻译、加工较大或更复杂的,蛋白质（特别是加工蛋白质的环境、过程、结果等是,植物微生物细胞极少有的）；能将目的蛋白分泌到培,养液中，从而简化了蛋白质的分离、纯化。,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,二、应用：,目前动物细胞生物反应器培养生产的生物,制品主要类型：,1,、病毒疫苗：,如乙肝疫苗（,HbsAg,）、脊髓灰质炎,疫苗（,Polio,）、狂犬疫苗（,Rabies,）等；,2,、非抗体免疫调节剂：,如干扰素（,IFN,）、白细胞,介素（,IL,）、,B,细胞生长因子（,BCGF,）、巨噬细胞激,活因子（,MAN,）、,T,细胞替代因子,(TRF),等。,3,、多肽生长因子：,神经生长因子（,NGF,）、成纤维,细胞生长因子（,FGF,）、表皮生长因子（,EGF,）、血,清生长因子（,SF,）等。,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养的应用,4,、酶类：,组织血纤维溶酶原激活计（,t-PA,）等；,5,、激素：,红细胞生产素（,EPO,）、促黄体生成素,（,LH,）、促滤泡素（,FSH,）,;,6,、肿瘤特异性抗原：,癌胚抗原（,CEA,）等；,7,、单克隆抗体,（,MCAB,）；,8,、病毒杀虫剂：,杆状病毒等。,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,三、关键技术,（一）细胞培养环境,1.,氨离子,2.,乳酸,3.,二氧化碳,4.,甲基乙二醛,5.,渗透压,6.,载体,（二）细胞死亡与凋亡,（三）培养基与细胞系,（四）过程监控,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,三、关键技术： （一）细胞培养环境：,1,、氨离子：,提高细胞密度的主要限制因子是培养环境中抑,制因素的积累。氨的积聚（来源于培养基和细胞的代谢）使细,胞内,UDP,氨基己糖增加，影响细胞的生长和蛋白质糖基化过,程。应防止培养基中,Gln,自然分解和尽量去除培养基中的氨。,2,、乳酸：,糖代谢产物。高浓度乳酸抑制乳酸脱氢酶,（,LDH,）活性减少乳酸产生阻止,NAD,的再生和丙酮酸,乳,酸转换,NADH,增加抑制糖酵解、低浓度丙酮酸、,Gln,消耗,减少产能减少抑制生长。因此应减少培养基中葡萄糖的浓,度（以减少乳酸）同时平衡葡萄糖与,Gln,的比例。,关键技术,细胞培养环境：,3,、二氧化碳：,CO,2,累积改变 细胞代谢水平、对细胞产生,毒性。应通过控制供气参数，平衡氧的输送及,CO,2,的去除，防,止生物反应器运转中,CO,2,的积累。,4,、甲基乙二醛（,MG),：,为丙糖磷酸去磷酸基（主要）、,脂类、氨基酸代谢产物。对细胞有潜在损伤。,MG,能改变氨基,酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基。葡萄糖浓度很高时，,MG,升,高。加小牛血清可降低,MG,的浓度。,关键技术,细胞培养环境：,5,、渗透压：,高渗透压提高细胞生产抗体的浓度、影响对数,生长期长短、细胞死亡速度。渗透压保护剂：甘氨酸、甜菜碱,和三甲基甘氨酸或脯氨酸可一定程度保护高渗对细胞生长的抑,制作用，并不影响目的蛋白的表达水平，还可使细胞长时间维,持高表达水平。,6,、载体：,用多孔微载体替代常规载体（细胞易受机械搅拌和喷气损伤）。,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,（,二）细胞死亡与凋亡：,细胞系在生物反应器中死亡主要是细胞凋亡。,bel-2,基因的过量表达：,能抑制,Gln,或缺氧引起的细,胞调亡、减少细胞特定成分的消耗、提高细胞密度和,目的蛋白的产量。可通过基因工程方法将,bel-2,这种抑,制细胞调亡的基因导入细胞。,在大规模动物细胞培养条件下，细胞死亡或凋亡,主要是：营养成分耗尽、有毒代谢产物增多。,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,（三）培养基与细胞系：,培养基：,历经天然培养基、合成培养基到现今的无,血清培养基。无血清培养基：避免了血清的批次、质,量、成分等对细胞培养的污染、毒性作用、不利于产,品纯化等不良影响。,细胞系或细胞珠不同,，其无血清培养基需求不同，,在细胞早期培养阶段，细胞对无血清培养基的适应性,往往是特异性的。,4.2.,7,动物细胞生物反应器大规模培养,（四）过程监控：,因大量细胞的代谢，培养环境会迅速改变，过程的,再线监控是非常重要的。,离线测定：需要时间长，来不及指导控制有关参数,和培养环境的优化、频繁取样易污染和增加费用。,在线测定：培养条件、代谢产物、目的产物等是大,规模培养动物细胞的需要。,重要（有效）参数：温度、,pH,、溶解氧浓度。,4.2.,8,动物细胞体外培养现状与展望,动物细胞培养工程目前存在的问题：,1.,细胞密度低，产物浓度低。,2.,细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能,力易丢失，或产物活性易降低。,3.,培养基、培养设备以及培养用微载体很昂贵。,4.,目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。,5.,在线监测不完善，限制了优良培养系统的开发。,4.2.,8,动物细胞体外培养现状与展望,今后应重点开展的工作：,1.,细胞培养过程中代谢和产物形成机制等方面的理,论研究。,2.,开发高密度生长、大量分泌目标产品的细胞系。,3.,开发细胞性能优良、细胞解离容易，并能重复使,用的新型廉价的微载体。,4.,研制高效的培养模式与系统，包括新型的无菌生,物反应器培养系统与工艺、先进的在线监测、分析与,自动控制技术等。,5.,相关基因工程与细胞培养技术结合的技术研究。,4.3 组织工程,4.3.1,概述,4.3.1.1,组织工程：,组织工程：,应用细胞生物学和工程学原理，将人体的某部分组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养、繁殖、扩增，然后移植到人体内所需要的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的的一种技术。,4.3.1.2,修复缺损器官的方法,修复缺损器官：,1,、自体移植：,“拆东墙补西墙”,增加患者痛苦、有的器官,独一无二而无法移植。,2,、异体移植：,最难解决免疫排斥反应，失败率极高；异体,器官来源有限，供不应求，难以实施移植。动物器官移植同样,存在免疫排斥反应，且有将动物的一些病毒传染给人类的危险,3,、组织代用品：,如硅胶、不锈钢、金属合金等，致命弱点,是与人体组织相容性差，不能长久使用，还易引起感染。,4.3.1.3,组织工程修复缺损器官,采用相容性好的生物可降解材料制成的各钟三维结,构的,细胞培养载体（支架），,在细胞增殖过程中，提,供营养物质，进行氧和二氧化碳交换，排泄废料，而,自身逐渐被人体降解、吸收、排泄，最后形成有特定,形态和功能的组织和器官。,其优势明显、应用前景诱人：,运用生物工程技术，,利用人体残余器官的少量正常细胞进行体外繁殖，既,可获得患者急需的具有相同功能的器官，又无排斥反,应，现已取得满意的成果。,4.3.1.4,组织工程现状,1,、在进行人体实验的再生的和实验室培育的器官：,骨骼、软骨、血管、皮肤、胚胎期的胎儿神经组织。,2,、正在实验室里生长成形的：肝脏、胰脏、心脏,乳房、手指、耳朵等。,3,、人们甚至正在尝试：,培育能充当药物释放渠道,的组织。,4.3.2 组织培养,4.3.2.1,上皮组织的体外培养,1.,体外培养细胞生长的形态特性,2.,表皮组织的体外培养,4.3.2.2,肌肉组织的体外培养,1.,肌肉组织的特点,2.,骨骼肌的培养,4.3.2.3,神经组织的体外培养,4.3.2.1,上皮组织的体外培养,一、体外培养上皮细胞生长的形态特征：,1,、体内上皮组织细胞：,排列紧密、形态较一致、,有极少量的细胞间质、被覆上皮分为单层和复层上皮,2,、体外培养时：,（,1,）部分保留体内生长的特征：成群存在或紧密,相连成单层膜，极少离群独存，表现群体依赖性 。,（,2,）接触抑制：培养一段时间后，细胞增多成片,后，运动和生长受到抑制。,4.3.2.1,上皮组织的体外培养,二、表皮组织的体外培养：,表皮细胞：角质形成细胞（角蛋白细胞，占绝大,多数）和非角质形成细胞（数量不多，更新慢）。,角质形成细胞体外培养较经典的方法,饲养层,细胞培养法（,Rheinwald,和,Green, 1975,）：,1,、原理及优点：,将分离的角质形成细胞种植在经,过处理的小鼠,3T3,滋养细胞形成的饲养层上，以促进,角质形成细胞的生长与分化；细胞接种密度抵、增殖,快、生长稳定、传代较好。,4.3.2.1,上皮组织的体外培养,二、表皮组织的体外培养：,2,、实验材料：,表皮细胞来源：,外科手术取包皮、乳腺、腹部皮肤，流产,胎儿皮肤最好，烧伤的依情况定。,饲养层细胞：,瑞士小鼠胚胎瘤的成纤维细胞系,3T3,，能有,力促进表皮细胞的贴壁生长，抑制混入的成纤维细胞生长。,3T3,细胞培养液：,DMEM,加,10%,胎牛血清、,4 mmolL,谷,氨酰胺、青霉素,100 IU,ml,、链霉素,100,g,ml,。,角质形成细胞培养液,：,DMEM,和,F,12,(31),加,10%,胎牛血,清、,4 mmolL,谷氨酰胺、青,100IU,ml,、链霉素,100,g,ml,、,5,g,ml,转铁蛋白、,5,g,ml,胰岛素等。,3,、培养过程：,（,1,）,3T3,细胞的传代培养：,小鼠胚胎瘤成纤维细胞系,3T3 ,PBS,平衡液洗涤,胰蛋白酶,-EDTA,消化,细胞变圆（显微镜,下观察）,弃消化液，加角质形成细胞培养液（消化液体积的,3,倍）,吹打分散细胞,接种培养，,35,天发生融合,接近融合,成单层时,传代培养。,（,2,）饲养层细胞的制备：,3T3,细胞覆盖瓶底一半时,换培养,液,培养,24h ,接近融合,加,110,g,ml,丝裂霉素,C,，培养,12h ,培养液洗涤细胞,3,次,胰蛋白酶消化,种植在培养瓶中,加角质形成细胞培养液,37,培养,贴壁后,12h,（再种植角,质形成细胞）。,（,3,）角质形成细胞的培养与传代：,取材消毒、分离皮肤和,皮下组织，切成,23mm,小快,中性蛋白酶消化（,4,过夜或,37,24h,）,针头分开表皮（薄而半透明）与真皮,胰蛋,白酶消化、离心、培养,细胞覆盖,70%,瓶底则传代。,4,、结果分析：,角质形成细胞培养,35,天后开始形成集落、扩展；,10,天左右集落融合形成皮片，细胞增速减慢；,3T 3,渐被排挤，形成整个皮片时，,3T3,细胞消失。,4.3.2.2,肌肉组织的体外培养,4.3.2.2.1,肌肉组织的特点：,又称肌组织，来自于中胚层具收缩能力的肌细胞。肌细胞,间有少量的结缔组织、丰富的血管和神经。,肌肉组织培养：肌肉组织植快或分散的肌细胞在离体环境中,存活、生长或发育。肌肉细胞富含肌原纤维具收缩能力，故培,养方法上有其特殊性。,骨骼肌细胞：中胚层细胞分化,成肌细胞,有丝分裂,融合,肌管细胞（长条管状，十多个核串珠状排列中间）,肌原纤,维增加，核向周边移动,骨骼肌细胞。,肌卫细胞：,乃骨骼肌细胞的干细胞（可被看作储备,的成体细胞）。紧贴骨骼肌细胞表面，扁平，有突起,能进行有丝分裂。肌肉受伤后，肌卫细胞分裂，转化,为肌细胞，进一步分化为肌纤维，填补受伤部位。,成熟的骨骼肌细胞不能进行有丝分裂。,4.3.2.2.2,骨骼肌的培养：,1,、材料：组织来源,胚胎或新生（,12,天最好）大鼠大腿,肌肉；培养液,Eagle MEM,或,DMEM,（添加,FCS,或和马血,清、鸡胚液）。,2,、培养过程,：,（,1,）处死动物，分离大腿肌肉，洗涤，胰蛋,白酶消化，收集悬浮细胞。（,2,）接种在,10% CO,2,、饱和湿度,环境中培养。（,3,）取原代或传代培养的细胞记数，接种在明,胶覆盖的培养板上，进行骨骼肌细胞的培养。,3,、骨骼肌培养的结果：,接种数小时后多数细胞贴壁，主要为单核（外观明显）细,胞；前,2,天是细胞增殖的主要时期，无明显细胞融合；,5052 h,后，细胞进入快速融和期；多核细胞快速生长导致纤维网的形,成；数天后融合结束，之后可观察到纤维的自发收缩现象；再,过,12,天，骨骼肌细胞的特征横纹开始变得明显；有时肉眼可,见到细胞收缩；适当条件下，细胞增殖一代时间为,1113 h,。,肌肉细胞系的建立：肌细胞的连续选择性传代，低密度接,种到有（或无）饲养层细胞的培养板上，形成单细胞克隆，可,以避免肌源性表型的过早丧失。（不同组织来源的细胞连续传,代会导致生长增殖活动停止，也有肌源性表型丧失的趋势）,4.3.2.3,神经组织的体外培养,神经细胞（神经元细胞和神经胶质细胞）组成神经,组织。即体外培养神经元细胞和神经胶质细胞。,培养对象、条件、设备等不同，培养方法不同。,差速处理富集脊髓神经元培养法：,1,、材料：,动物：胚龄,14,天的大鼠胚胎；,培养液：,（,1,）含血清的培养液：,DMEM,加,20%,胎,牛血清、,50 IUml,的青霉素、,50,g,ml,的链霉素,（,2,）无血清的培养液：,DMEM,加,5,g,ml,牛胰岛,素、,50,g,ml,人转铁蛋白。（,3,）多聚赖氨酸液。,4.3.2.3,神经组织的体外培养,2,、培养步骤：,（,1,）取大鼠胸、腰段脊髓，剔除脊膜，显微镜下分离暗灰色,组织，剪碎；,（,2,）,37 0.25%,胰蛋白酶消化,15 min,，胎牛血清终止酶活性,后，离心、悬浮、吹打，再离心，制得细胞悬浮液；,（,3,）,10ml,细胞悬液于直径,100mm,培养皿中，,37,、,5%,的,CO,2,孵育,23h,，利于最大限度贴壁；,（,4,）未贴壁的细胞离心，重新获得细胞悬浮液，记数；,（,5,）用,多聚赖氨酸液预先包被培养皿（,37,）,24h,，每皿,接种,106,个悬浮细胞；,（,6,）,CO,2,培养箱,孵育,2h,，换无血清化学限制培养基继续培,养，,4,天后换液。,4.3.2.3,神经组织,的体外培养,3,、结果：,用神经元特异性标志物进行免疫细胞化学鉴定证,实，大约,98%,的细胞是神经元性质的细胞。,因材料来源于胚胎组织，所以培养物中还有少量的,神经前体细胞。,硼酸盐缓冲液配制的,多聚赖氨酸生长基质，其效果好于,蒸馏水。,4.4 器官培养,4.4.1,概述：,1,、器官培养：,主要采用类似于组织培养中植块培养的方式,培养器官型植块。,2,、基本技术特点：,取出动物器官或进一步修整成器官型植,块，将其接种到培养基上或培养液中，在适当的营养、气相、,生长基质等条件下，使其存活和生长。,3,、发展历史：,最早,Leob,（,1897,年）进行成年兔一些器官的,尝试性培养,血浆凝快培养兔的肝、肾、甲状腺、卵巢等,（,3,天）；,20,世纪初器官培养进入活跃时期（主要限于胚胎器,官）；,20,世纪,50,年代进入蓬勃发展阶段（不限于胚胎器官），,技术、器皿、培养基等有了许多改良和革新。,4.4,.1,器官培养,概述,迄今，文献报道已在培养的人体器官：乳腺、眼、,内耳、肝、脑、角膜、肾、肺、骨、皮肤、子宫、胸,腺、肠、牙、气管、副甲状腺、心脏、食管等等。,4,、现代器官培养的共同点：,（,1,）培养对象：非胚胎和胚胎器官的一部分；,（,2,）浸泡在培养液中培养；,（,3,）被培养组织器官的细胞以简单扩散方式获得氧,气和其他营养物质、排除,CO,2,和其他代谢废物。,4.4,.1,器官培养概述,5,、器官培养的特征：,器官培养与器官保存、组织培养、细胞培养不同：,（,1,）被培养器官存活较长时间，,保持相对正常功,能，器官内的细胞有正常功能甚至增殖。器官保存无,细胞增殖。,（,2,）被培养物是完整器官或具有完整功能的某一,器官的一部分。,如肝、肺的一叶，一片皮肤等。组织,培养物已丧失原器官的完整功能。,（,3,）器官培养无器官数量的增加。,细胞培养有细,胞数量的增加。,胚胎与成体器官培养的特点,1,、基本原则：,（,1,）提供充足的营养和,O,2,，及时排除代谢废物；,（,2,）抑制细胞从植快向外迁移。,2,、胚胎器官培养的特点：,（,1,）能量来源是糖酵解，培养时不需补充,O,2,。,（,2,）早期胚胎器官（原基）体积较小，可将整个,器官进行培养。,（,3,）胚胎器官细胞生长活跃，迁移能力强，容易,从植快中迁移出来。,胚胎与成体器官培养的特点,3,、成体器官培养的特点：,（,1,）能量来自有氧代谢，,因此需充足的,O,2,供应，,器官植块中心才不会缺氧而坏死。,（）只能成功培养几周,，且仅能维持其存活和保,持其结构功能（因其高耗氧率和细胞的高度分化）。,（）器官内部细胞迁移不明显。,4.4.3,传统的器官培养方法,1,、表玻璃器官培养法：,ell,和,Robinson,（,1929,）建立。表玻璃上加鸡胚,质和鸡血浆凝固培养的器官移植其上放入培养,皿内入箱培养。,已成功用于研究胚胎原基的形态发生，改良后可用,于激素、维生素、致癌因子对哺乳动物成年器官的作,用等方面的研究。,4.4.3,传统的器官培养方法,2,、琼脂凝胶培养法：,培养液加琼脂形成凝胶，故培养基质不液化，器官,组织的细胞在其上的迁移受到抑制。,用此法成功进行了胚胎器官的发育及形态发生的研,究，以及肿瘤组织的培养。,4.4.3,传统的器官培养方法,3,、悬浮培养法：,是最简便最早使用的液体培养法，可随时加影响因,子或生化分析（琼脂凝胶培养法只有在转培养时才能,进行）。,器官型植块置于液体培养基中，适当摇动培养瓶，,以使液面的氧尽可能多地溶解在培养液中，并防止植,快下沉而黏附。,4.4.3,传统的器官培养方法,4,、直接漂浮培养法：,器官浸入培养液中，不能持续接触空气（,O,2,）易,于缺氧坏死。,器官型植块置于液体培养基与气象界面上培养，,植块可同时获取营养和充足的氧气。,此法适合于高耗氧的成体器官的培养。如皮肤表,皮向上、真皮向下直接漂浮在培养液表面，并向培养,液中充入,70%,的,O,2,，获成功（,Medarwar,1948,）。,4.4.3,传统的器官培养方法,5,、擦镜纸培养法：,直接漂浮培养法的不足：器官易转曲。,最早的在气,液表面进行器官培养的方法。,擦镜纸（具有疏水性）漂浮在培养液的表面，作,为器官的支持物，营养物可透过擦镜纸进入器官。,4.4.3,传统的器官培养方法,6,、金属格栅器官培养法：,漂浮支持物很难持久地漂浮。,金属格栅替代漂浮支持物（,Trowell,1954,）。,最初为高耗氧的成体器官培养而设计。,金属格栅：坚实、平稳、安全，支托或移动大量,的培养器官。,4.4.3,传统的器官培养方法,7,、琼脂小岛器官培养法：,琼脂制成小岛状的支持物，放在液体培养基中，,将器官置于琼脂上进行培养。琼脂起支持和防止培养,器官的细胞发生迁移的作用。,优点：,可直接观察器官的生长情况；维持器官在,体外较长时间生长、抑制细胞迁移（琼脂凝胶培养法,的优点）；换液简便（液体培养基的优点）。,4.4.3,传统的器官培养方法,8,、旋转管培养法：,最早于,1933,年（,Gey,）建立。,要培养的器官植块用血浆凝块固定于旋转管一侧，,管内加入适量培养液，水平旋转进行培养。,旋转培养期间，植块断续地与培养液和气相接触，,可获得充足的营养和氧气。,4.4.3,传统的器官培养方法,9,、摇摆式器官培养法：,旋转管培养法虽是动态培养，但操作复杂。,1976,年（,Barret,等）创立摇摆式器官培养法：采,用平台式摇摆仪使培养的器官植块交替地浸入培养液,和暴露于混合气体环境中，还能迅速清除器官的代谢,产物，器官的存活时间较长。,4.4.4,现代器官培养,灌流式器官培养法,培养系统的特征：,采用一个连有倾斜注射器外套的培养容器，新鲜,培养液从储液罐通过注射器不断流入培养容器，液体,由外套的出口端流出，其流速由恒流泵控制。空气通,过过滤器进入储液罐对培养液进行充氧和稳定,pH,。样,品从样品收集口收集。,优点：,系统简单易行、可达很好的无菌效果、适,合器官的长期培养、代谢产物连续收集。,1938,年，卡雷尔和林德伯格尝试了采用无菌循环装,置培养猫的甲状腺，并维持数星期。他们用泵将营养,液泵入器官内，并经过器官循环后流出，这是最早的,灌注式培养器官的尝试。,目前，器官灌流技术应用于器官培养已取得了良好,效果。陈细华等采用长时间灌流式器官培养方法进行,了草鱼脑垂体的完整器官长期培养，,82,天内没有发现,污染，脑垂体保持正常的生长素分泌能力。,1,2,3,4,5,6,7,3,4,5,8,9,10,15,11,12,13,14,一种长时间灌流式器官培养装置图,1.,进气口,2.,空气过滤器,3.,乳胶管,4.,针头,5.,胶塞,6.,储液瓶,7.,培养液,8.,注射器外套,9.,器官植块,10.,琼脂,11.,输液管,12.,膨大部,13.,恒流泵,14.,样品收集口,培养箱,4.4.,5,器官培养应用举例,4.4.5.1,软骨的培养：,软骨培养常用于研究软骨与骨的生长分化及影响因,素。材料常用胚胎动物长骨（最常用鸡胚长骨）取材,时注意动物的年龄。软骨