体内药物分析课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,体内药物分析课件,体内药物分析概述,一、体内药物分析的定义,研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质和量变化规律的,分析方法学,。,药物分析,法医鉴定,毒物分析,二、体内药物分析的意义,（一）在新药评价和开发中的意义,1,全面质量控制,(,毒奶粉事件,),药品三原则,:,安全,合理和有效,2,新药报批,3,为设计新药提供信息,从代谢产物中开发新药,(,保泰松和羟基保泰松,),前药设计,新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等,以上内容必须通过,测定体内药物浓度,得以解决,1,血药浓度与药理作用,思考题,:,剂量增加,药效是否成正比增加,?,（二）临床合理用药中的意义,2.,影响血药浓度的因素,（,1,）机体因素,a,生理因素,:,年龄、性别、生理状况（妊娠期）,b,病理因素（胃肠道、肝脏、肾脏）,c,遗传因素（乙酰基转移酶代谢异烟肼、乙醇脱氢酶）,（,2,）药物因素,a,剂型因素（生物利用度问题）,b,药物合并使用（酶抑、酶促）,c,环境因素（环境污染、食品、个人精神状态）,分析目标,药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性,它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价特别重要,.,机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程,其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关,母药,药物特有代谢产物,体内内源性生物活性物质,三、体内药物分析的对象,Company Logo,人,动物,鼠,兔,犬,大鼠,小鼠,男,女,等等,猴,猩猩,都是一些志愿者,须动物管理与使用委员会同意,Company Logo,分析对象,Company Logo,药物在体内的形态,游离型代谢产物,游离型原药,结合型原药,结合型代谢产物,情形极为复杂,缀合物,分子间力结合,化学共价结合,称为,两类,四、体内药物分析的特点,1,干扰杂质多,(,内源性物质,分离纯化,),2,样品浓度低,(,富集,净化,),3,取样量少,4,工作量大,5,时间短,6,有一定设备,五、体内药物分析方法,1.,色谱分析法：,TLC,、,GC,、,HPLC,、,HPCE,2.,免疫分析法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等,3.,生物学方法：微生物学方法用于抗生素类药物的体内分析，如生物利用度，生物等效性或临床,TDM,等体内样品测定,第一节 常用体内样品的制备与贮藏,一、生物样品的采集与贮藏,体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。,12,（一）样品的采集,1,血样,血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。,血细胞,血浆（,plasma,）,血小板,血清（,serum,）,血细胞,测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓,抗凝,自然,全血,血液,2,尿样,目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度,特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离,优点：易得，属非损伤性取样，样品量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物，是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低，不需去蛋白处理。,缺点： 与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、,pH,影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。,3,唾液,唾液是无损伤性采样，易,采集,。,一些药物的唾液药浓（,S,）与,血浆游离药浓,(P),密切相关，因此，在,TDM,中可利用测定,S,代替,P,监测；唾液样品也可用于药代动力学研究。,优点：不受时间和地点的限制，可反复采集，采集时无痛苦、无感染危险；唾液成分比血液、尿液简单，提取方便，有时可直接上样测定；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。,缺点： 唾液是各腺体分泌的的混合液体，其组成发生经时变动。,S/P,只有少数药物是恒定值。 蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度低。 对有些患者（昏迷）不能采集唾液样品。,16,（二）样品的贮藏,1,血样（血浆、血清）及时分离冷藏，,-70,加入稳定 剂,NaF,2,尿样,尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，,4,保存,加入防腐剂,a,1%,甲苯,b,饱和氯仿,c,pH,改变,3,唾液：同血样,第二节 生物样品的预处理与制备,30%,以上工作和费用用在样品前处理上,18,二、生物样品的预处理,（一）预处理的目的,将药物从缀合物（尿）或结合物中释放出来，以测定药物的总浓度,将微量药物从复杂的介质中纯化、富集出来,（分离浓缩）,防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度和选择性等（,出现浑浊和沉淀，杂质多，与试剂起反应，影响色谱柱寿命）,（二）处理方法选择的一般原则,1,药物理化性质,pKa,亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性,2,浓度范围 灵敏的方法,3,测定的目的 定性 定量 母体 代谢,4,生物样品的种类,5,样品处理与分析方法的选择, 专一性 灵敏性,处理步骤与方法,全血,/,血浆，组织,(1),蛋白沉淀,(2),调节,pH,选择性溶剂提取,放射免疫分析,残渣,化学衍生化,(,提取烃基化,),碱回提,酸回提,HPLC,UV,、,FLD,、,ECD,TLC,分光光度法,UV,、,FLD,GC,FID,ECD,N/P-FID,GC-MS,去除蛋白质方法,分离与富集方法,微透析技术,缀合物水解,化学衍生化,萃取,如何进行？,常用体内样品预处理方法,Company Logo,蛋白质的去除,加入与水混融的有机溶剂,(,乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃,),加入中性盐,(,饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐,),加入强酸,(,三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸,),加入金属沉淀剂,(,CuSO,4,-Na,2,WO,4,、,ZnSO,4,-NaOH,),缀合物的水解,酸水解,(,盐酸,),酶水解,(,葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素,),有机破坏,(,硝酸,-,高氯酸消化,),分离、纯化与浓集,液,-,液萃取法,(,Liquid-Liquid Extraction,LLE,),液,-,固萃取法,(,Liquid-Solid Extraction,LSE,),溶解剂法,(,硝酸,-,高氯酸消化,),常用体内样品预处理方法,（三）生物样品去蛋白处理,目的： 去除蛋白质,可使结合型的药物释放出来,，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能，延长使用期限,1,加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐,甲醇 乙腈 甲醇,1:2,乙腈,（,NH4,）,2,SO4 NaCl,2,加入酸性沉淀剂,三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，,pH,低于等电点,3,组织酶消化法,加入酶使蛋白质水解,优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解,可改善对蛋白结合率强的药物的回收率,不产生乳化,4,其他 加热 超滤,（四）生物样品缀合物水解,1,酸水解 ：，,100,，,30min,， 条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。,2,酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在，,37,数小时，条件温和，选择性强，但费用较高。,3,溶剂解：缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解。,为测定尿液中药物总量，要将缀合物水解：,Company Logo,是以多孔半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术，选用不同的孔径的不对称膜，即可按照分子量大小进行分离,适合,TDM,血样分析,Therapeutic drug monitoring,（五）超滤分离法,why?,某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规,HPLC,及,GC,检测的需要，因此进行衍生,How for GC?,硅烷化,酰化,烷基化,不对称化,（六）化学衍生法,Company Logo,why?,某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规,HPLC,及,GC,检测的需要，因此进行衍生,How for LC?,UV,FL,非对映衍生化,（五）分离、纯化与浓集,有,差别,才有可能分离！,生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物、同时服用的其他药物，组成一个极其复杂的混合物。,如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？,31,生物样品的萃取,优点：与杂质分离简便 浓集 提取率高,1,、液液萃取法,原理：多数药物是亲脂性的,，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物样品中的大多数,内源性杂质是强极性的水溶性物质（,差别）,。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。,采用,LLE,要考虑的几个问题,（,1,）溶剂的选择与纯度要求,纯度,AR,以上,了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相溶原则选用对药物的未电离分子可溶，而对电离形式的分子不溶（光谱分析法）沸点低、易挥发、浓集与水不相混溶无毒，不易燃烧不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）具有较高的化学稳定性和惰性不影响紫外测定,毒性大的尽量不用,33,（,3,）水相的,PH,值,主要由药物的,pKa,决定！,（,2,）有机溶剂相和水相的体积比,11,或,21,由实际情况决定，文献中有的,101,以上,生物样品一般多在碱性下提取！,34,由于血药浓度较低，提取时需浓集,传统的浓集方法主要有两种：一种是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。,另一种是挥去提取溶剂后，再用少量适合的溶剂溶解后测定。,35,衡量提取方法优劣的一个重要指标就是提取回收率，它是指药物从生物样品中被分离出来用于测定的比例，一般应高于,60%,-,乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于,80%,药物的萃取,36,文献上常提到的,LLE,的缺点,传统萃取方式回收率低、样品用量大、繁琐费时、溶剂用量大、溶剂毒性大、易乳化、不能自动化操作,37,关于固相萃取小柱：,a.,常见的固相萃取柱分为三部分：,医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛板,(,20m,),和填料,(,多为,40-60m,，,80-100m,),。,b.,常用规格：,100mg/1ml,，,200mg/3ml,，,500mg/3ml,，,1g/6ml,等。以,100mg/1ml,为例：,其中,100mg,为填料的质量，,1ml,是空柱管的体积。,c.,一次性使用：,为避免交叉污染，保证检测可靠性，,SPE,柱通常是一次性使用的。,2.,固相萃取,(Solid Phase Extraction,，简称,SPE),法,38,SPE,填料,亲脂型,:,大孔吸附树脂，亲脂性键合硅胶。,亲水型：硅胶、硅藻土。,离子交换：苯磺酸基，羧基等。,39,固相萃取操作一般有五步：,活化,甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一定的溶剂环境。,平衡,水或适当缓冲液冲洗小柱。,上样,将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。弃去废液,淋洗,水或缓冲液最大程度除去干扰物。,洗脱,用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。,亲脂性,键合相硅胶,SPE,柱的实验步骤：,40,41,亲水型填料,用作,SPE,的亲水型填料有硅藻土、硅胶、棉纤维等，其原理为分配作用。填料为支持物，水基质中极性强的成分与填料结合牢固，流动相为与水不相混溶的有机溶剂，较亲脂的药物易分布于流动相，从而达到萃取的目的。,亲水型填料,SPE,有较高的萃取回收率（大于,80%,），但洗脱剂用量较大（一般大于,5ml,），无浓集作用，萃取液较干净。,42,SPE,优点：,1,、不发生乳化；,2,、适应的极性范围较广；,3,、提取效率高；,4,、方便快速；,5,、溶剂用量少；,6,、易于自动化；,7,、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。,目前，商品化固相提取小柱（,cartridge,）的应用已比较普遍。,最大的缺点： 贵,20,多元,/,支,43,三种方法的优缺点比较,44,第三节 体内药物分析方法的建立与评价,一、分析方法,根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的,灵敏度,专属性,色谱法,+,+,HPLC GC,免疫法,+,+,免疫交叉反应，重现性,生物学方法,+,+,特异性较差，需与色谱法平行使用,二、分析方法的设计依据,方法的建立,原始方法改进创新,创立方法,1,做好文献总结,2,充分了解药物特征及体内状况,pH,、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况,3,明确测定目的、要求,目的,4,结合实验室条件,设备条件,预处理方法,药浓监测,药代动力学研究,母体药物和代谢物,三、分析方法的建立,方法的验证,特异性,标准曲线与定量范围,定量下限,准确度与精密度,稳定性,回收率,分析过程的质量控制,未知样品浓度超出范围的处理,相关物质测定,其它方法验证,四、体内样品分析方法与方法验证,（一,),、特异性,所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。,Company Logo,(,二,),、标准曲线与线性范围,6.4,12.8,19.225.6 32,3,2.4,1.8,1.2,0.6,0,茶碱,(,g/ml),Y,10,-2,X,+6.15310,-3,r,至少,6,个浓度点建立标准曲线,线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推,最低浓度点偏差在,20%,其余浓度点的偏差在,15%,。,四、体内样品分析方法与方法验证,四、分析方法的评价,可行性和可靠性,1,准确度,accuracy,测定结果与真实性的差异,用回收率表示,接近,100%,相对恒定,绝对回收率,绝对回收率,=,提取回收率,=,萃取回收率,测定血浆样品中药物浓度,/,相同浓度的标准液,=,绝对回收率,考虑,3,个浓度（高、中、低）,分布在标准曲线成上、中、下,一般要求绝对回收率在,70%,一般方法,HPLC,内标,内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值,10%,相对回收率,相对回收率,=,方法学回收率,药物系列浓度,+,血样标准曲线,取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值,15%,，定量限,20%,2,精密度,precision,标准差,SD,相对标准性偏差,RSD,不大于,15%,，定量限不大于,20%,日间精密度日内精密度,3,灵敏度（,sensitivity,）,检测的最小量,（,1,）检测限（,LOD,）,从背景中检测到的最小药物浓度：,S/N,3,的绝对量,LOD=3N/S,（,N,噪间,S,被测物信号,/,单位重量）,N=1mm,取,2g,ml,样品，,20l,进样,峰度,30mm,LOD=4ng,（,2,）定量限,(LOQ),在一定精密度和准确度前提下求得最低检测量，通常以标准曲线最低点作为一定量限，也可,S/N=10,作为定量限，实际测定时，满足,35,个半衰期浓度，或,C,max,1/101/20,（,3,）最低检测浓度,可以进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大,小,等因素有关,最低检测浓度,=LOQ/,进样体积,体内浓度检测限,=,仪器浓度检测限,稀释度,1ml,0.1ml,体内检测限,=,仪,1ml,10ml,体内检测限,=,仪,10,（,4,）提高灵敏度的方法,提高仪器灵敏度,提高进样量,降低仪器噪音,富集待测组分,6,稳定性（,stability,）,（,1,）长期贮存稳定性,-20-70,（,2,）短期室温稳定性,室温放置,424h,（,3,）冷冻解冻稳定性,冷冻,解冻,冷冻,解冻,（,4,）贮备液稳定性 贮备液在室温或冷冻条件下,谢谢大家！,