放射免疫分析技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,放射免疫分析技术,（Radioimmunoassay，RIA）,1,核医学,治疗：,肿瘤、甲亢等,诊断 体内PET、SPECT、,放射免疫成像等,体外放射免疫分析（RIA）,2,标记免疫分析技术,用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法,特点：,敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果,三大标记免疫分析技术：,放射免疫、荧光免疫、酶免疫,检测方法 检测范围,生化、常规免疫 mg,g,（10,-3,10,-6,g）,荧光免疫、酶免疫,gng,（10,-6,10,-9,g）,放射免疫、发光免疫 ngpg（10,-9,10,-12,g）,PCR pgfg（10,-12,10,-15,g）,3,一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA）,女科学家 R.Yalow（美,1921）1950末,发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖,1. 基本原理,（1）竞争结合分析：Ag + Ab, AgAb,*,Ag + Ab,*,AgAb,（2）IRMA（免疫放射分析）：,2. 常用标记核素：,（1）,125,I：,射线，半衰期 60 天,（2）,3,H：,射线，半衰期 12.3 年,3. 测量仪器,（1）,计数仪,（2）,液闪仪,4,4. 基本试剂,（1）标准品与质控品,a.,意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据,b.,要求：,化学结构上与待测物有相同的化学结构,化学纯度上对竞争反应有干扰的杂质的含量低,含量准确,注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期,c.,种类：国际标准、国家标准、企业标准,5,（2）标记物,a.,对标记物的要求,比活度高：即单位物质的放射性强度高,生物活性及免疫活性与标记前改变小,放射化学纯度高：应 95%,稳定性好：标记的同位素不易脱落,6,b.,标记方法：,氯胺-T 法：最常用的,125,I 标记法，I 与酪氨酸共价结合，方法简便，但易造成蛋白质的损伤,乳过氧化酶法：,Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应时间长,置换法：,3,H 最常用,c.,标记产物的纯化：常用 Sephadex 层析，也可用硅胶 G 薄板层析或 HPLC 分离,d.,标记产物的鉴定：常用 RIA 法,最大结合百分率,标准曲线比较法,e.,半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），再对载体作标记,7,（3）特异性结合抗体,a.,对特异性结合抗体的要求：,亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用 K 值表示，反映灵敏度,特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应）低,滴度（效价）高：指结合 50% 标记抗原时抗体的稀释度高,稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定,b.,抗体的制备,选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊,应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +,卡介苗,）,选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数,8,c.,抗体的纯化,去除杂抗体：用抗原吸附法,提取特异性 IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和层析纯化,d.,抗体的鉴定,鉴定内容：效价、亲和力、特异性,鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA,e.,单克隆抗体的使用：,用于 IRMA 或 RIA，特异性高,不一定优于传统的多克隆抗体,9,5. 竞争性放射免疫分析法的建立,（1）反应方式,a.,平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育,b.,顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入标记抗原。可提高反应灵敏度,c.,STAT 法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件,（2）反应体系,a.,缓冲液：常用 0.050.1 mol/L pH 7.47.5 磷酸或 Tris-HCl 缓冲液。根据需要定,b.,反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差,c.,反应时间：,d.,反应温度：,e.,反应物比例：减少抗体与标记的用量可提高灵敏度；增加抗体与标记的用量可扩大测定范围,10,（3）分离方法,a.,对分离方法的要求：,使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全,分离后便于放射性测量,分离效果不受外界干扰因素的影响,操作简便、分离迅速、重复性好,与游离标记物的非特异性结合尽可能小,试剂来源广泛、价格低廉,b.,常用的分离方法,二抗法：非特异性低，但沉淀较差,PEG 法,：,沉淀较好,，,但非特异性高,二抗-PEG 法：较好，现常用,磁化颗粒法：,固相法：现较常用,11,（4）添加剂的问题,a.,防腐剂：低浓度 NaN,3,对分析的影响小,b.,抗凝剂：EDTA、肝素对分析无影响,c.,抑肽酶：对一般分析无影响,12,6. 放射免疫分析的数据处理,（1）数据处理的基本步骤,a.,作图法,b.,数学模型法,（2）几种数学模型,a.,一般多项式函数：普适性差，现基本不用,b.,直线法：logit-lg 转换,c.,四参数 Logistic 模型：目前常用,13,7. 放射免疫分析的质量控制,（1）放射免疫分析中的误差及引起误差的原因,a.,系统误差：由于某些特定的原因造成的带有倾向性的误差,试剂误差：标准品不准；标记物变质；抗体失效；分离剂的影响,仪器误差：测量仪器不准；加样器不准,分离误差：分离不完全或失误,数据处理误差：选用数学模型不当,b.,随机误差：偶然因素造成的误差,同位素计数的统计涨落,14,（2）放射免疫分析的质量控制指标,a.,精密度：即重复性，是评价随机误差的指标，用标准差（,SD,）、变异系数（,CV,）、精密度图（,PDP,）表示,b.,准确度：指测定值与真值的符合程度，偏离程度叫偏差，常以偏离真值的百分比表示，常用回收试验及平行性实验来评价,c.,灵敏度：指测定方法的最小可测值， 即能与零剂量相区别的最小剂量，以零剂量点结合率的均数减两个标准差后的结合率的对应值作为最小可测值,d.,特异性：常用交叉反应率来表示,e.,稳定性：即批间的重复性， 常以剂量反应曲线参数的稳定性来评价，主要有零管结合率（B,0,%）、非特异性结合率（NSB）、剂量反应曲线函数、相关系数,f.,临床有效性：诊断符合率，假阴性率、假阳性率,15,（3）日常检测工作中的内部质量控制,a.,实验室内的批内质量控制,b.,实验室内的批间质量控制,c.,实验室之间的外部质量控制：对同一样品在不同实验室测定结果作评判,16,8. 放射免疫分析的临床应用,临床常用近 200 种,（1）肿瘤相关抗原的测定：,AFP、CEA 、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA 等,（2）激素的测定：,下丘脑-垂体-甲状腺轴激素，下丘脑-垂体-性腺轴激素，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等,（3）非激素蛋白质的测定：,铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、III 型前胶原肽、层黏蛋白等,（4）酶的测定：,前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE 等,（5）药物及维生素的测定：,地高辛、叶酸、VitB12 等,（6）免疫分子的测定：,各种 Ig、抗 DNA、IL、CD、CIC,（7）病原学研究：,现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定的价值,（8）其它：,甘胆酸、透明质酸等,17,二、荧光免疫分析技术（Fluoroimmunoassay，FIA）,1941年 Coons 等发明，最早建立的一种标记免疫技术,用荧光素标记抗体或抗原，借助荧光检测仪察看荧光现象或测量荧光强度，从而判断抗原或抗体的分布或含量,18,常用荧光免疫的类型,（1）荧光免疫染色：主要用于抗原抗体的定位，用荧光显微镜观察,（2）荧光免疫测定,a.,荧光偏振免疫测定（FPIA）,b.,荧光酶免疫测定（FEIA）,（3）时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）,19,三、酶免疫测定（EIA）,1. 均相酶免疫测定法：,主要用于测小分子抗原。酶标抗原与待测抗原竞争结合定量抗体,2. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：,为固相、非均相酶免疫测定法，目前应用最广泛的定性标记免疫分析技术，也可用于定量分析。1971 年 van Weeman（荷）等发明,3. 生物素-亲和素系统免疫检测法,生物素标记一抗或二抗，酶标记亲和素,4. 斑点免疫结合试验,用醋酸纤维素膜为固相载体,（1）斑点酶免疫渗滤试验,（2）斑点免疫金渗滤试验,（3）斑点免疫金层析试验,20,四、发光免疫分析技术（Luminescent immunoassay，LIA）,1. 原理：,（1）LIA：,在氧化还原反应中电子被激发，可释放光子，使鲁米诺（氨基苯二酰肼类）发光剂发光。用发光剂标记抗原或抗体,（2）发光酶免疫测定（LEIA）：,用能催化发光反应的酶（如葡萄糖氧化酶）标记抗原或抗体，酶可使发光剂发光。该法经酶促放大，更灵敏,根据发光的强弱对抗原或抗体定量,2. 优点：,无放射性，故现正逐步取代 RIA,21,