甾体激素类药物的分析4

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第十章 甾体激素类药物的分析,Analysis of steroid hormones,1,激素,（,Hormone,，荷尔蒙）,是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生物活性物质。激素作用于特定的称为,靶器官,的组织、细胞上而发挥作用。如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。,2,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,基本结构,概 述,甾体激素类药物均具有,环戊烷骈多氢菲,母核。,3,分类,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素,孕激素,雌激素,蛋白同化激素,4,（一）肾上腺皮质激素,4,3,酮基,（紫外吸收）,天然,皮质激素,：,氢化可的松,母核有,21,个碳原子,C,17,醇酮基,（还原性）,5,醋酸地塞米松,结构修饰,曲安息龙,地塞米松磷酸钠,提高结构稳定性,增强抗炎作用,6,（二）雄性激素和蛋白同化激素,天然雄性激素：,睾酮,4,3,酮基,4,位,引入卤素或,19,位,去甲基或将,A,环,结构改造,均明显,降低雄性,作用，,增加蛋白同化,作用,母核有,19,个碳原子,A,环中有,4,3,酮基结构,7,结构修饰,增加脂溶性，制成油注射剂,可口服、延效,丙酸睾酮,甲睾酮,增加位阻，难代谢氧化，稳定性增强,可口服,8,蛋白同化激素,苯丙酸诺龙,4-,氯醋酸睾丸素,母核有,18,或,19,个碳原子,9,（三）孕激素,C,17,-,-,甲酮基,4,3,酮基,天然孕激素：,黄体酮,母核有,21,个碳原子,口服被迅速破坏失效，只能肌注,10,结构修饰,醋酸甲地孕酮（孕酮类孕激素）,炔诺孕酮（睾酮类孕激素）,炔诺酮（睾酮类孕激素）,口服、长效,口服、长效，,17-OH,作成庚酸酯，注射一次可维持,3,个月,11,（四）雌激素,天然的雌性激素：,雌二醇,母核有,18,个碳原子,A,环为苯环，,C,3,位上有酚羟基，,C,17,位上有,-,羟基,结构不稳定，口服无效,12,结构修饰,炔雌醇,戊酸雌二醇,苯甲酸雌二醇,乙炔基引入，使仲醇变叔醇，增加空间位阻，阻碍酶对药物的氧化代谢，,可口服,17,位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，,延效,3,位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，,延效,可口服,高效,长效,13,人工合成代用品：,非甾体化合物,己烯雌二酚,高效、长效,14,4,3,酮,C,17,醇酮基,C,17,羟基,C,17,甲酮基,A,环为,3OH,苯环,肾上腺皮质激素,+,+,雄性与蛋白同化激素,+,+,雌性激素,+,+,孕激素,+,+,鉴别反应,UV,、羰基试剂、氨基脲反应,还原性（碱性酒石酸酮、氨制,AgNO,3,）,可成酯,与亚硝基铁氰化钠、间二硝基苯反应,UV,、与重氮苯磺酸盐反应,二、特殊官能团与分析方法,15,第二节 鉴别试验,一、物理常数的测定,二、化学鉴别法,三、制备衍生物测定熔点,四、紫外分光光度法,五、红外分光光度,六、薄层色谱法,七、高效液相色谱法,16,第二节 鉴别试验,二、化学鉴别法,（一）呈色反应,（,1,）与强酸的呈色反应,强酸：,H,2,SO,4,、,H,3,PO,4,、,HClO,4,、,HCl,原理：酮基先质子化，形成正碳离子，再与,HSO,4,-,作用呈色。,17,显 色,荧光,加水稀释,氢化可的松,棕黄色至红色,绿色,黄色至橙黄色,炔雌醇,橙红,黄绿,玫红,絮状,炔雌醚,橙红,黄绿,红色,泼尼松,黄,橙,黄色渐变蓝绿色,泼尼松龙,深红,灰色,絮状,地塞米松,淡红棕色,颜色消失,苯甲酸雌二醇,黄绿色,蓝色,淡橙色,与硫酸显色反应,18,1,、,C,3,酮基和,C,20,酮基,（,1,）与羰基试剂,2,4-,二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼反应生成,腙,。,(2),官能团的呈色反应,（,2,）与羟胺或氨基脲分别生成具有一定熔点的,肟或缩氨脲,。,19,+,HCl,黄色,3,，,20-,双腙,室温下长时间加热,20,结论：,成腙反应中,C,20,酮基受,C,18,甲基的空间位阻影响，反应较慢，需加热或较长时间放置，才完成反应。,C,11,酮基受,C,18,、,C,19,位甲基甲基的阻碍，不发生反应。,C,3,酮基空间位阻最小，最易起反应，室温下先生成单腙。,21,2,、,C,17,醇酮基的呈色反应（,还原性,）,能与,碱性酒石酸铜,试液（斐林试液）、,氨制,AgNO,3,试液（多伦试液）、,四氮唑盐,反应呈色。,其中以四氮唑盐的显色反应最为常用，不但可用作层析法的显色剂，还可用于含量测定,.,适用：肾上腺皮质激素。,22,2Cu,2+,+ 4OH,-,+ Cu,2,O + H,2,O,橙红色,2Ag,+,+ 2OH,-,+2Ag + CH,3,COOH,黑色,醋酸去氧皮质酮,23,+,H,2,O,+ CH,3,COOH,+,+,OH,-,醋酸泼尼松,深红色的三苯甲鐕,四氮唑盐,24,结论：,三苯甲,鐕,于,490nm,处显示最大吸收，可用比色法测含量。,四氮唑盐反应还用于,肾上腺皮质激素,类药物中杂质,“,有关物质,”,检查的显色剂。,反应在碱性条件下（水解）进行。,25,适用：具有,甲酮基,或,活泼亚甲基,的甾体激素类药物。,3.,甲酮基的呈色反应,能与,亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛,反应呈色。,孕激素,（,1,）甲酮基：,黄体酮专属性反应。,黄体酮,其他甾体,亚硝基铁氰化钠,蓝紫色,淡橙色或不显色,26,结论：,在碱性条件下进行。,与亚硝基铁氰化钠反应称为碱性硝普钠反应,。,（,2,）亚甲基的反应：,硫酸普拉睾酮,乙醇,间二硝基苯,氢氧化钠,紫红色,27,适用：雌激素类药物。,4.,酚羟基的呈色反应,能与,重氮苯磺酸,发生偶合反应，生成,红色偶氮,染料。,苯甲酸雌二醇,H,+,+,红色,28,有机氟,F,有机破坏,有机氯,5,、卤元素的呈色反应,茜素氟蓝,硝酸亚铈,硝酸,硝酸银,呈蓝紫色,Cl,AgCl,氯原子结合在母核环上,29,6,、沉淀反应,（,1,）与碱性酒石酸铜（斐林试液）的沉淀反应,（,2,）氨制,AgNO,3,（多伦试液）的沉淀反应,（,3,）与,AgNO,3,的沉淀反应,适用：含,炔基,的甾体激素类药物（,炔雌醇、炔诺酮,）。,机理：,HNO,3,+,+,NaOH,滴定，电位法指示终点,30,（,4,）与,HNO,3,-AgNO,3,的沉淀反应,适用：甾体激素类药物,C,21,位上有氯原子取代，如丙酸氯倍他索。,机理：,有机氯原子,水解,加热,无机氯原子,结合在母核,环上的氯原子,氧瓶燃烧法,破坏,无机氯原子,硝酸,硝酸银,AgCl,31,原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴别。,7,、水解产物的反应,适用： 本类药物,C,3,、,C,17,或,C,21,位上羟基的酯,结果：,醋酸酯,水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯。,戊酸或己酸酯,类水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，进行鉴别。,32,三、制备衍生物测熔点,（二）酯的水解,醇制,KOH,水解,m.p.,为,150, 156,（一）酯的生成,+ KOH,丙酸睾丸素,睾丸素,m.p.,为,201,+,33,m.p.,约,182,（分解）,（三）缩氨基脲的生成,苯丙酸诺龙,苯丙酸诺龙缩氨脲,H,2,NCONHNH,2,（四）酮肟的生成,炔诺酮,HONH,2,炔诺酮肟,m.p.,约,195,（分解）,醋酸泼尼松,34,-3-,酮,（五）,UV-ViS,分光光度法,240nm,左右,280nm,左右,苯环,其他共轭结构,原 理,200-760nm,有特征吸收。,方 法,可规定最大吸收波长、,A,、吸收系数、,A,大,/A,小,。,35,示 例,曲安息龙,丙酸倍氯米松,溶剂,甲醇,乙醇,浓度,20g/ml,20g/ml,结果判断,在,238nm,处有最大吸收,在,239nm,处有最大吸收，,A,为,0.57,0.60,，在,239nm,与,263nm,处的吸收度比值为,2.25,2.45,36,结构特征：,酚羟基,C,17,OH,C,17,乙炔基,eg1:,炔雌醇,（六）,IR,法,原料药,37,1505cm,-1,3505cm,-1,3300cm,-1,1590cm,-1,3610cm,-1,酚羟基,醇羟基,1615cm,-1,苯环的骨架振动,38,eg2,：黄体酮,-3-,酮,结构特征：,C,17,-,酮基,39,1700cm,-1,C=O,20,位酮基,1665cm,-1,3,位酮基,1615cm,-1,870cm,-1,C-H,双键,40,七、,TLC,法,八、,HPLC,应用,甾体激素类药物原料与制剂的鉴别,甾体激素类药物原料与制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）,方法,对照品法,对照品法,结果判断,要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同,要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的,t,R,与对照品峰的,t,R,一致,41,第三节 特殊杂质检查,杂质来源：,原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂。,一、有关物质的检查,其他甾体：,有些杂质与该,甾体激素药物结构类似,，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显得很重要。,42,检查方法：,（具有一定分离能力）,判定方法：规定杂质斑点数目,规定杂质斑点颜色,1,、,TLC,法（自身对照法）,eg,：氢化可的松中其他甾体的检查,供试液：本品,+,氯仿,-,甲醇（,9,：,1,） 浓度：,3.0mg/ml,对照液：供试液（,3.0mg/ml,）,+,氯仿,-,甲醇（,9,：,1,）,60g/ml,层析：供试液 对照液 点样、展开、斑点检出。,判断：供试液如显杂质斑点，不得多于,3,个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,43,2,、,HPLC,法（,自身对照法,）,图,A,中峰,1,面积的四分之三,判定方法：,规定杂质峰数目,规定杂质峰面积,44,二、游离磷酸盐的检查,方法：对照品比色法,杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯化时残存的过量磷酸盐。,结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度。,740nm,原理：供试液,+,钼酸铵,+1-,氨基,-2-,萘酚,-4-,磺酸 钼蓝,45,三、有机溶剂残留量的检查,eg,：地塞米松磷酸钠,方法：,GC,色谱法,杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量甲醇和丙酮。,结果判断：不得出现,甲醇峰，甲醇含量,0.3,丙酮规定不得过,5.0%,46,四、,硒的检查,氧瓶燃烧,二氨基萘比色法测定,杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激素类药物，在生产中使用二氧化硒,(SeO,2,),脱氢工艺，药物可能引入杂质硒。,方法：,药物,结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度,（,0.005,0.01,）,。,378nm,五、雌酮,六、乙炔基,47,第四节 含量测定,常用方法,容量法,比色法,紫外分光光度法,荧光法,气相色谱法,高效液相色谱,四氮唑盐比色法,异烟肼比色法,铁,-,酚试剂比色法,48,一、,HPLC,法,USP,、,BP,、,JP,均采用,方法：,RP,HPLC,（内标法）,测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂。,eg,：黄体酮的含量测定色谱条件：固定相,ODS,，检测波长,254nm,流动相 甲醇,-,水（,65:35,）,内标物 己烯雌酚,系统适用性试验：,n1000,，,R,符合规定。,49,测定样品：黄体酮原料、注射液。定量方法：内标法 内标,-1,50,二、,UV-ViS,分光光度法,1,、,-3-,酮,240nm,（,）,2,、苯环,280nm,（,）,雌激素,肾上腺皮质激素,雄性激素和蛋白同化激素,孕激素,（一）,UV,分光光度法,缺点：,专属性不强,51,示例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查,（,1,）配制供试液，取,10,片分别进行测定（,2,）测定：,240nm,（,3,）计算,52,（二） 比色法,有色甲瓒,四氮唑盐,醇酮基,-,a,-,17,C,OH,-,1,、 四氮唑盐比色法,（,1,）原理：肾上腺皮质激素类,C,17,-,醇酮基强还原性。,H,氯化三苯四氮唑,（,TTC,）,三苯甲瓒,深红,53,蓝四氮唑（,BT,）,525 nm,54,25,氢氧化四甲基铵,对照液,供试液,A,TTC,40,45,暗,（,2,）方法：对照品法,（,3,）影响因素,A.,基团对反应速度的影响,C,11,= O,C,11,OH,C,21,OH,未酯化,C,21,-OH,酯化,55,B,、溶剂和水分的影响,以无水乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过,5,对结果没有影响。,C,、,O,2,与光线的影响,避光、隔绝空气、快速、充,N,2,D,、碱的种类及加入顺序,以氢氧化四甲基铵的结果最佳,加入顺序：,皮质激素溶液,四氮唑盐,碱试液,56,E.,温度与时间,室温（,25,）反应,40,45 min,F.,干扰物的影响,油膏、冷霜等制剂含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对,BT,的显色反应有干扰，要先分离后测定。,57,（,1,） 原理,异烟腙（黄）,HCl,420nm,2,、异烟肼比色法,C,3,-,酮基,+,异烟肼,H,2,O,肾上腺皮质激素,雄性激素,蛋白同化激素,孕激素,58,（,2,）方法：对照品法,60,异烟肼,无水甲醇,对照液,供试液,A,暗,60,59,（,3,）影响因素,A.,反应速度（反应专属性）,C,3,=O,C,17,= O,、,C,20,= O,C,11,= O,不反应,B.,溶剂的选择,异烟肼盐酸盐受溶解度的影响,无水甲醇,无水乙醇,对试剂的稳定性好,呈色强度较无水乙醇中高,对植物油的溶解度小,60,C.,水分、温度、,O,2,与光线的影响,含水量,腙水解,A%,O,2,与光线对反应的影响不大,t ,D.,酸的种类和浓度及异烟肼的浓度,酸,:,异烟肼,= 2:1,盐酸浓度,0.0074mol/L,最大,A,异烟肼浓度,0.00365mol/L,61,（,1,）原理,max,=465,3,、,Kober,反应比色法,桃红,黄色,雌激素,2,O,H,乙醇,-,4,2,SO,H,max,=515,62,雌二醇,-3-,甲醚,max,=465,max,=515,63,(,NH,4,),2,Fe,(SO,4,),2,+ H,2,SO,4,+ H,2,O,2,+,苯酚,铁酚试剂,Iron-phenol Reagent,铁盐的作用,加快黄色产物的形成、转化,加强红色产物的稳定性,酚的作用,加快红色产物的形成,消除反应产生的荧光,64,练习与思考,A,型题,1.,醋酸地塞米松的鉴别方法是,A.,三氯化铁反应,B.,水解反应,C.,柯柏反应,D.,与碱性酒石酸铜试液反应,E.,双缩脲反应,65,B,型题,A.,亚硝基铁氰化钠反应,B.Vitali,反应,C.Kedde,反应,D.,绿奎宁,(thalleiaqllin),反应,E.,碱试酒石酸铜试液的反应,1.,黄体酮,2.,醋酸地塞米松,3.,地高辛,4.,硫酸奎宁,A,E,C,D,66,简答题：,1,、简述异烟肼比色法测定甾体类激素药物含量的原理及注意事项？,2,、简述四氮唑比色法中的注意事项。,3,、甾体类激素药物可能含有哪些特殊杂质？各采用什么方法检查？,4,、甾体类激素药物有哪些鉴别方法？,67,