第四章(质粒载体)

单击以编辑,母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 质粒载体,第一节 质粒载体概况,第二节 质粒,DNA,的复制与拷贝数的控制,第三节 质粒载体的构建,第四节 重要的质粒载体,第五节 质粒载体的稳定性问题,第一节 质粒载体的概况,一 质粒的定义、命名、分类、分布,二 质粒的基本生物学特性,三 质粒的分离与纯化,一、质粒的定义、命名、分类、分布,定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外的自我复制并稳定遗传的环状双链,DNA,分子。,命名：小写字母,p,代表质粒，两个大写字母代表发明者，后接实验编号，,分类：,分布：,1）根据质粒的性状特征,F,质粒：,又叫,F,因子或性质粒(,sexplasmid,)。,R,质粒：,通称抗药性因子。编码有一种或数,种抗菌素抗性基因，,Co1,质粒 ：,产生大肠杆菌素因子。编码,有控制大肠杆菌素合成的基因,质粒分类,2）根据质粒的传递性,3）根据质粒的拷贝数,4）根据质粒和细菌的关系,4.质粒分布、大小和数目,二、质粒的基本特性,1.寄生性,2质粒,DNA,构型,3,质粒,DNA,编码的表型,4,质粒,DNA,的转移,5,质粒,DNA,的迁移作用,6质粒,DNA,的复制类型,7质粒的不亲和性,8. 其他特性,质粒的基本生物学特性,1.寄生性,2质,粒,DNA,(,图41,),大肠杆菌质粒分子的结构示意图,质粒,DNA,分子具有,三种构型,SC,构型:,共价闭合环形,DNA(,cccDNA,)，,超螺旋的,SC,构型,；,OC,构型:,开环,DNA(,ocDNA,)，,OC,构型,；,L,构型:,发生双链断裂而形成线性分子,(,LDNA)，,L,构型,。（图42）,环形双链,DNA,质粒分子的三种构型,质粒,DNA,的分子构型 质粒,DNA,琼脂糖 凝胶电泳模式图,(,a) (b),OC,SC,L,3.质粒,DNA,编码的表型,抗性特征,、,代谢特征,、,修饰寄主生活方式的因子,，,质粒,DNA,编码的基因有,产生抗菌素的基因,、,芳香族化合物降解基因,、,糖酵解基因、产生肠毒素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因，以及寄主控制的限制与修饰系统的基因等,4质粒,DNA,的转移,(1) 接合型质粒的自我传递,(2),F,质粒,(,3 )质粒,DNA,的接合转移,细胞交配对的形成,质粒,DNA,的转移,细菌的接合作用,在合适的条件下，雄性细胞和雌性细胞混合培养，形成 雌雄细胞配对过程为细菌的接合作用(,conjugation)。,在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的,F,因子按滚环复制模式(,rolling circle replication model)，,(1) 接合型质粒的自我传递,格兰氏阴性细菌的质粒分成接合型和非接合型。,接合型的质粒,(,conjugative,plasmid,)，,又叫自我转移的质粒。除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,非接合型的质粒,(,nonconjugative,plasmid,)，,不能自我转移是因为没有了控制细胞配对和接合转移的基因。,(2),F,质粒,又叫,F,因子(,ferti1ity factor) ，,单拷贝的接合型质粒，其分子量约为94,kb，,共编码19个转移基因(,tra,)。F,质粒有三种存在方式：,(,i),以染色体外环形双链质粒,DNA,形式存在，不带有染色体的基因或,DNA,区段。这样的细胞叫做,F,+,细胞。,(,ii),以染色体外环形双链质粒,DNA,形式存在，同时还携带着细菌的染色体基因或,DNA,区段。这样的细胞叫做,F,细胞。,(,iii),以线性,DNA,形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞叫做,Hfr,细胞(高频重组细胞)。,大肠杆菌,F,因子基因图,(3)质粒,DNA,的接合转移机制,细胞交配对的形成：,大肠杆菌,F,质粒编码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。,质粒,DNA,的转移,F,质粒,DNA,的转移是从转移起点,oriT,开始的。,大肠杆菌,F,质粒转移区结构-该区编码着控制细胞接合作用的基因,质粒,DNA,的接合转移及复制,5质粒,DNA,的迁移作用,共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。,F,因子带动,Co1E1,质粒转移的条件,6.质粒的复制类型,两种不同的复制型：,“严紧型” (,stringentplasmid,)；,“,松驰型” (,relaxedplasmid,)。,质粒拷贝数的定义：,每个细菌细胞中所含有的质粒,DNA,分子的数目,7质粒,的不亲和性,(1) 质粒的不亲和性现象,(2) 质粒不亲和性的分子基础,8.质粒的其他特性,稳定性：维持一定的拷贝数,同源性：不同的质粒有相同的同源区,重组性：质粒间、质粒同染色体间重组,消除和恢复性等特性,三.质粒,DNA,的分离与纯化,1氯化铯密度梯度离心法,2碱变性法,3微量碱变性法,4影响质粒,DNA,产量的因素,(1)寄主菌株的遗传背景,(2)质粒的拷贝数及分子大小,1氯化铯密度梯度离心法,2碱变性法,3微量碱变性法,4影响,质粒,DNA,产量的因素,(1) 寄主菌株的遗传背景,(2) 质粒的拷贝数及分子大小,分离纯化质粒,DNA,的程序,寄主菌株的遗传背景,使用,endA,基因发生突变,的(,endAl,),大肠杆菌寄主菌株，,endA,基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶,I,的能力，增进了质粒,DNA,分子的稳定性。,第二节,质粒,DNA,的复制与 拷贝数的控制,1,质粒,DNA,复制的多样性,2,ColEl,质粒,DNA,复制的启动,3质粒,DNA,拷贝数的控制,(1)天然质粒拷贝数的控制,(2)杂种质粒拷贝数的控制,4质粒复制控制的分子模型,(1)抑制蛋白质稀释模型,(2)自体阻遏蛋白质模型,质粒,DNA,的复制与拷贝数的控制,1质粒,DNA,复制的多样性,(,i),对寄主酶的依赖性,(,ii) DNA,聚合酶的利用,(,iii),复制的方向性,(,iv),复制的终止,(,v),复制,型,2,ColE1,质粒,DNA,复制的启动,3质,粒,DNA,拷贝数的控制,(1)天然质粒拷贝数的控制,(2)杂种质粒拷贝数的控制,Co1El、,pSCl,01,及其杂种质粒,pSCl34,的,DNA,复制,4质粒复制控制的分子模型,(1)抑制蛋白质稀释模型,(2)自体阻遏蛋白质模型,质粒,DNA,复制控制的抑制蛋白质稀释模型,质粒,DNA,复制控制的自体阻遏蛋白质模型,第三节质粒载体的,构建,1天然质粒用作克隆载体的局限性,2质粒载体必须具备的基本条件,3质粒载体的选择记号,4不同类型的质粒载体,(1)高拷贝数的质粒载体,(2)低拷贝数的质粒载体,(3)失控的质粒载体,(4)插入失活型的质粒载体,(5)正选择的质粒载体,(6)表达型的质粒载体,1 天然质粒用作克隆载体的局限性,天然质粒有,Co1E1、RSF2124,和,PSCl01,等。天然质粒的局限性：如质粒的分子量较大，拷贝数较低，只有一个抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组体分子,等。,2质粒载体必须具备的基本条件,(,i),具有复制起点,(,ii),具有可,选择的标记,(,iii),具有若干限制酶单一识别位点,(,iv),具有较小的分子量和较高的拷贝数,(,v),作为表达载体还有启动子,，,转录转移信号，终止子序列等片段。,3质粒载体的选择记号,在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号，有新陈代谢特性、对大肠杆菌素,E1,的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗菌素抗性记号有四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性，卡那霉素抗性等,正选择质粒载体,PKN80,的形体,图,4不同类型的质粒载体,(1)高拷贝数的质粒载体,(2)低拷贝数的质粒载体,(3)失控的质粒载体,(4)插入失活型的质粒载体,(5)正选择的质粒载体,(6)表达型的质粒载体,复制基因(,replicator,),选择性记号,克隆位点,基因克隆质粒载体的三种组成,二、构建载体的一般程序,1.根据原则设计,2.分离,纯化,DNA,片段,3.,DNA,片段连接重组,4.重组连接液转化,5.筛选重组转化子,6.载体的有关,DNA,序列分析,第四节重要的质粒载体,一.大肠杆菌质粒载体,1,pSCl01,质粒载体,2,Co1E1,质粒载体,3,pBR322,质粒载体,4,pUC,质粒载体,5丧失迁移功能的质粒载体,6.能在体外转录克隆基因的质粒载体,一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图,二、酵母菌质粒载体（穿梭质粒）,酵母2,质粒,乳酸克鲁维酵母中的线性质粒,大肠杆菌酵母穿梭质粒,酵母表达型质粒,酵母分泌型表达质粒,酵母人工染色体,YAC,1,pSCl01,质粒载体,2,CoEEl,质粒载体,pSCl01,质粒作载体克隆非洲爪赡的基因,3,pBR322,质粒载体,(1,),pBR322,质粒载体的构建,(2,),pBR322,质粒载体的优点,具有较小的分子量,具有两种抗菌素抗性基因可供作转,化子的选择记号。,具较高的拷贝数,(3),pBR322,质粒载体的改良,pBR322,质粒载体的构建过程,pBR322,质粒载体的形体图,pBR322,质粒载体的结构来源,pBR322,质粒载体,tet,基因的插入失活效应,pBH20,pBR322,EcoRI,EcoRI,Klenow,Hae,Hae,EcoRI,EcoRI,plac,HaeIII,HindIII,BamHI,Hha,lac,HindIII,EcoRI,ligation,pBH20,HindIII,BamHI,Hha,lac,HindIII,EcoRI,EcoRI,BamHI,Samastetin,BamHI,EcoRI,ligation,psomI,HindIII,EcoRI,BamHI,Samastetin,Hha,lac,PstI,lac,psomI,HindIII,EcoRI,BamHI,Samastetin,Hha,PstI,pBR322,PstI,EcoRI,Amp,EcoRI,PstI,EcoRI,PstI,pSomII,PstI,EcoRI,BamHI,Amp,Somastetin,ligation,pSomII,EcoRI,BamHI,Amp,Somastetin,PstI,EcoRI,EcoRI,Lac-gal,-3,EcoRI,EcoRI,ligation,p,SomIII,Lac-gal,somastetin,4,pUC,质粒载体,(1,),pUC,质粒载体的结构,(2),pUC,质粒载体的优点,第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数,第二，适用于组织化学方法检测重组体,第三，具有多克隆位,点,MCS,区段,pUCl8,及,PUCl9,质粒载体的形体图,丧失迁移功能的,pBR327,质粒载体的形体,图,5其它重要的质粒载体,(1)丧失迁移功能的质粒载体,拥有较高水平的拷贝数,失去了,bom,位点，即便在共存,的,F,质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。,(2)能在体外转录克隆基因的质粒载体,pSP64,质粒载体的形体,图,pSP64,与,PSP65,质粒载体的多克隆位点区的核苷酸序列结构,(3)穿梭质粒载体,穿梭质粒载体,(,shuttleplasmidvector,)，,是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,穿梭质粒载体，有大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体，大肠杆菌酿酒酵母穿梭质粒载体。,大肠杆菌酿酒酵母穿梭质粒载体,第六节质粒载体的稳定性问题,1质粒载体不稳定性的类型,(1)结构的不稳定性,(2)分离的不稳定性,2影响质粒载体稳定性的主要因素,(1)新陈代谢负荷,(2)拷贝数差度,(3)寄主重组体系,3随机分配的分子机理,(1),控制环路使质粒拷贝数的限制在最低的水平,(2)位点特异的重组作用消除质粒的寡聚体,(3)调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生,(4)大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性,4主动分配的分子机理,(1)分配区的结构与功能,(2)预配对模型,(3)二聚体的解离有助于质粒的主动分配,(4)寄主致死功能对质粒稳定性的效应,1质粒载体不稳定性的类型,质粒的不稳定性(,plasmid,instability)，,包括分离的不稳定性(,segrega,tionalinstability,),和结构的不稳定性(,structuralinstability,),(1),结构的不稳定性,DNA,的缺失、插入和重排都是造成质粒载体结构不稳定性的原因。,(2)分离的不稳定性,在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，也是导致质粒不稳定性的重要原因。,2影响质粒载体稳定性的主要因素,(1)新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应,(2)拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响,(3)寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应,在细胞分裂过程中质粒的分配方式,3随机分配的分子机理,(1)通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平,(2)通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体,(3)通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生,(4)大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性,4主动分配的分子机理,(1)分配区的结构与功能,(2)预配对模型,(3)二聚体的解离有助于质粒的主动分配,(4)寄主致死功能对质粒稳定性的效应,R1,质粒,parB,(,hok,sok,),体系对分裂后细胞的致死效应,思考题一,1.基因工程中常用的载体主要有哪几类？,2.质粒,DNA,的三种构型是什么？它们在琼脂糖凝胶中的迁移速度有什么区别？,3.从基因工程的安全性考虑有利的质粒载体是接合型还是非接合型质粒？为什么？,4.两个质粒基因不能稳定的共存在于一个细胞，是什么原因？,5.什么是质粒的不相容性？相容性？机制？,6.质粒如何维持在细胞中的稳定性？,7.最简单的基因克隆载体至少具备哪三个条件？,8.,colE1,质粒,DNA,复制启动主要涉及到哪几种酶和哪种蛋白因子？,9.复制子由哪三部分组成？,思考题二,10.,pBR322,的构建过程通过哪两个途径？它的复制子、四环素及氨卡青霉素抗性基因分别来源什么质粒？,11.,pUC,质粒是通过哪两种质粒改造而来的？它的复制子和,Ampr,抗性标记克隆位点分别来自于什么载体？,12.通过生长激素释放基因的克隆与表达载体构建得到什么启示？,13.基因工程中真正天然的质粒有哪几个？,14.,YAC,具有什么结构？为什么克隆大片段时它具有优越性？,15.2,质粒具有什么特性可使它配对形成大小两个哑铃结构？,16.什么叫穿梭质粒？,17.什么是质粒的带动转移？,18.酵母质粒载体主要有哪几种类型？,19.质粒不稳定主要有哪两类？,