医学分子生物学新技术应用

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,医学分子生物学新技术应用,代谢组学及研究技术,microRNA,的研究及应用,免疫共沉淀技术（,Co-Immunoprecipitation,）,4.,胞内,RNA,分子可视技术,第一节 代谢组学及其研究进展,什么是代谢组学？,代谢组学研究方法,代谢组学分析技术,气相色谱,-,质谱联用技术（,GC-MS,）,液相色谱,-,质谱联用技术（,LC-MS,）,毛细管电泳,-,质谱联用技术（,CE-MS,）,核磁共振技术（,NMR,）,代谢组学研究什么？,生物体系（细胞、组织或生物体）,代谢产物发生变化（种类，随时间变化）,特定基因突变,环境变化,生物体系,代谢组学研究对象,体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体,糖类,脂类,蛋白质,水,无机盐,维生素,各种物质代谢之间互有联系，相互依存。,消化吸收,中间代谢,废物排泄,机体物质代谢不断受到精细调节,机体有精细的调节机制，调节代谢的强度、方向和速度,内外环境的变化,对机体代谢造成影响,适应环境的变化,精细的调节控制,代谢组,(metabolome),是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合,包含一系列不同化学型的分子,比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。,代谢组学,(metabonomics,metabolomics),来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。,代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态,协助阐释新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性,帮助人们更系统地认识生物体。进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识。,代谢物化学分析技术及数据分析技术的发展极大促进了诸多生物、医学问题的研究,这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用。,普遍定义,代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。,研究对象：相对分子质量小于,1000,的内源性小分子。,代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂类、金属离子。,特点,1.,关注于内源性小分子化合物。,2.,对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究,3.,内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。,4.,内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。,代谢组学的发展,1982,1983,1984,1989,1999,2000,2001,2002,2007,Van De Greef,:,publication of MS for urine profiling,Sadler, Buckingham and Nicholson:,First publication on,1,H-NMR of blood and plasma,Nicholson, et al.:,Multi-component analysis of spectra data from rat urine,Nicholson and Wilson:,NMR spectroscopy of biofluids,Nicholson:,Definition of Metabonomics,Haselden, et al.:,First independent Pharma publication of Metabonomics,Nicholson, Lindon, and Holmes:,Publication in Nature on Metabonomics,Holmes and Antti,Explanation of statistics in Metabonomics,Increasing # of publications,研究方法,研究步骤：,生物组织，体液经,灭活预处理,多个方法联用,应用,药物研发,疾病研究,植物代谢组学,微生物代谢组学,中药现代化,连接图数据库,Connections Map DB,京都基因与基因组百科全书,KEGG,(),生物化学途径,ExPASy,互联网主要代谢途径,main metabolic pathways on Internert, MMP,Duke,博士植物化学和民族植物学数据库,Arizona,大学天然数据库,Wiley_handbook of gc-ms,新药及其代谢产物质谱库,“,肿瘤”代谢组数据库,Pubmed,化合物数据库,NIST,质谱数据库,一些有用的数据库：,代谢组学分析技术,气相色谱,-,质谱联用技术（,GC-MS),液相色谱,-,质谱联用技术 （,LC-MS),毛细管电泳,-,质谱联用技术 （,CE-MS),核磁共振技术 （,NMR,）,分析技术,1.,气相色谱,-,质谱联用技术（,GC-MS,）,工作原理：,气相色谱仪,接口,质谱仪,常压,高真空,离子源,质量分析器,检测器,质谱仪的基本结构及工作流程,几种新的,GC-MS,技术,全二维气相色谱质谱技术（,GCGC-TOFMS,）,气化室,检测器,色谱柱,1,色谱柱,2,调制器,研究实例,用,Leco ChromaTOF soft ware,得到的质荷比为,73,（,m/z,）的离子碎片典型,GCGC-TOFMS,二维血浆色谱图（,Analytica Chimica Acta,，,2009,，,633,，,257-262,）,大连化物所许国旺教授分析确定,5,种糖尿病病源标记物：葡萄糖、,2-,羟基异丁酸、亚麻油酸、软脂酸、磷酸。 脂肪酸代谢紊乱,GC-MS,适用于挥发性的代谢物。对于非挥发性代谢物的分析需要经过化学衍生。,多用于环境分析、大气有毒气体分析、某些疾病诊断等。,2.,液相色谱,-,质谱联用技术（,LC-MS,）,LC,工作原理：,液相色谱,-,质谱联用的新技术,4000Q Trap LC/MS/MS,高效液相色谱系统配合液相质谱系统。健康和慢性乙肝病人的血清样本。,使用,PLS-DA,处理代谢数据正常组和慢性乙肝组对照（,Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561,）,新型液相色谱技术,UPLC,新型超高液相色谱仪,HPLC,色谱柱填料颗粒：,3,、,5m,UPLC,色谱柱填料颗粒：,分离能力得到空前提高,比较（,a,）,HPLC,和（,b,）,UPLC,用于美沙芬的代谢物,TOP,质谱全扫描（,Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19, 843,）,UPLC,在代谢组学中的研究优势,UPLC,相对于传统的,HPLC,有更好的分离效率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质谱联用的接口，有助于检出更多的代谢物。,提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用的定性定量结果。,UPLC,与质谱联用为代谢组学研究提供更加高效、灵敏的研究平台。,毛细管电泳,-,质谱联用技术（,CE-MS,）,代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物（糖酵解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物。）,毛细管电泳是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（,m/z,）不同造成迁移速率不同来实现分离。,适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分析。,毛细管电泳,-,质谱联用分析仪（兰州理工大学）型号：,P/ACE MDQ-Deca XP plus,厂家：美国,Beckan Coulter-Finnigan,（,NMR,）,基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物结构中的,H,和,C,原子的位置信息。,1,H-NMR,：在排除杂质及水峰的干扰下，,1,H-NMR,的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱则反映出样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢产物。,核磁共振,电子云：,基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学。主要用于反应化合物结构中的,H,和,C,原子的位置信息。,hr-MAS of biological tissue,相同强度,Lipid,CH,2,-CO,Lipid,CH,2,-C=C,Lipid,CH,2,-CH,2,-CO,Lipid,CH,2,Lipid,CH,3,Citrate,Lactate,Alanine,放大,人前列腺组织,（,prostate tissu,）良性,vs.,恶性,癌症组织给出更多的脂类物含量（,lipid,）！,代谢组学研究一般包括四个步骤：,第一步，给予生物体一定的刺激。,第二步，代谢组数据的采集。用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。,第三步，,建立表征代谢特征的时空模型。在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析,(Principle Components Analysis, PCA),。,第四步，,建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。,microRNA,的研究与应用,35,10.1.1,概述,10.1.2. microRNA,的分子生物学研究方法,10.1.3 microRNA,的实验技术,10.1.4 microRNA,与疾病,内容结构,36,概述,miRNA,是由,2125,个核苷酸组成的非编码,RNA,；,它通过与靶基因的,3-UTR,的配对，促进,mRNA,的降解或抑制,mRNA,的翻译从而抑制其靶基因的表达；,它在生物体,生长发育,、,细胞增殖,、,分化,、,凋亡,以及人类,各种疾病,的发生发展过程中发挥重要的调控作用。,?,什么是,miRNA,？,37,概述,MicroRNA,的发现,lin-4: Lee,等人于,1993,年在线虫中通过胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现，是第一个被发现的,miRNA,。,lin-4,在,L1,L2,阶段大量表达，如缺失，则导致幼虫发育停顿。,L1,L2,L3,L4,L1L4,，线虫发育的四个不同阶段,38,let-7: Rinhart,等人于,2000,年在线虫发现第二个,miRNA,，,let-7,。,let-7,在,L3,L4,阶段大量表达，控制幼虫的,L4,阶段向成虫阶段发育转换。,L1L4,，线虫发育的四个不同阶段,L1,L2,L3,L4,概述,MicroRNA,的发现,39,MicroRNA,的起源与生物合成过程,1. miRNA,基因被转录成,pri-miRNA (RNA,聚合酶,),；,2. pri-miRNA,被剪切成具有,70-100,个核苷 酸 的,pre-miRNA (Drosha,DGCR8),；,3. pre-miRNA,从核内被转移至胞质,(Exportin-5, Ran-GTP),；,4. pre-miRNA,被剪切成,21-25,个核苷酸的双链,RNA,双体,(Dicer,TRBP,PACT),；,5.,双链,RNA,双体中成熟,miRNA,链会选择性整合入,RISC,并与,mRNA,互补配对,。,40,MicroRNA,的起源与生物合成过程,microRNA gene,Pol ,Drosha/DGCR8,Pri-miRNA,Pre-miRNA,Cytoplasm,Dicer/TRBP/PACT,duplex intermediate,RISC,mature miRNA,miRNA biogenesis,Nucleus,Exportin-5/,Ran-GTP,41,miRNA,与,siRNA,的性质比较,miRNA,siRNA,相同点,长度及特征,分子量约,22nt,，,5,端是磷酸基，,3,端是羟基,合成的底物,均由双链,RNA,或,RNA,前体加工而来,Dicer,酶,依赖,Dicer,酶并具有,Dicer,加工产物的特征,Argonaute,家族蛋白,均需,Argonaute,家族蛋白参与,RISC,均为,RISC,组分，在介导沉默机制上有相似之处,作用方式,均可抑制靶基因翻译或导致,mRNA,降解,进化关系,两种假设：,siRNA,是,miRNA,的补充；,miRNA,在进化过程中替代了,siRNA,引自 方福德, microRNA,的研究方法与应用,中国协和医科大学出版社, 2008,42,miRNA,siRNA,不同点,机制性质,是生物体正常的调控机制,往往是外源引起,直接来源,发夹状,pre-miRNA,长链,dsRNA,分子结构,单链,RNA,双链,RNA,，,3,端有,2,个非配对碱基,对靶基因,mRNA,特异性,较低，一个突变不影响,miRNA,的抑制作用,较高，一个突变容易引起,RNAi,沉默效应的改变,作用方式,miRNA,途径,RNAi,互补性,不完全互补，存在错配现象,一般要求完全互补,生物学功能,对机体的生长发育有重要作用,抗病毒的防御机制；沉默过表达的,mRNA,；保护基因组免受转座子侵入,重要特性,高度的保守性、时序性和组织特异性,高度特异性,续表,1,43,miRNA,siRNA,不同点,作用机制,通过与,miRNP,核蛋白体复合物结合，识别靶基因,mRNA,，并与之部分互补，从而抑制其翻译。在动物中，成熟的,miRNA,与蛋白质复合物,miRNP,结合，引导这种复合物通过部分互补结合,mRNA 3-UTR,，从而抑制其翻译。,miRNA,也可切割完全互补的,mRNA,渗入,RISC,中，引导复合物与,mRNA,完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开,siRNA,，通过反义,siRNA,链识别目的,mRNA,，通过内切酶活性切割目的片段，再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。,siRNA,也可以抑制具有短片段互补性的,mRNA,翻译,加工过程,不对称加工，仅剪切,pre-miRNA,一个侧臂，其他部分降解,对称地剪切来源于双链,RNA,前体的两个侧臂,对,RNA,的影响,与,mRNA,的稳定性无关,影响,mRNA,的稳定性,作用位置,作用于靶基因,3-UTR,作用于,mRNA,的任何部位,生物学意义,主要在发育过程中发挥作用，调节内源性基因的表达,不参与生物发育，是,RNAi,的产物，原始作用是抑制转座子活性与抵御病毒感染,续表,2,44,MicroRNA,的鉴定,正向遗传学的突变筛查方法（,最初几个,miRNA,分子的发现；效率不高）；,cDNA,克隆技术,（有优势也有不足）；,生物信息学预测方法,（是实验预测方法有益和必要的补充；目前两个最主要的,miRNA,基因预测工具：,MiRscan,和,miRseeker,）,当然计算机预测的,miRNA,必须经过,RT-PCR,或,Northern,试验分析才能鉴定,45,MicroRNA,的特征,广泛存在于真核生物中,是一类内源性表达的非编码短序列,RNA,本身不具有开放阅读框,(ORF),；,成熟的,miRNA,长度通常为,21,25nt,；,miRNA,在进化上具有高度保守性；,miRNA,表达具有细胞和组织特异性，同时具有时序性,如拟南芥中的,miR-171,仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；,20-24h,的果蝇胚胎提取物中可发现,miR-12,，却找不到,miR3-miR6,，在成年果蝇中表达的,miR-1,和,let-7,也无法在果蝇胚胎中表达,46,MicroRNA,的功能,miRNA,通过基因的转录后调控过程参与了生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的各个过程。,如线虫幼虫发育阶段的转换，哺乳动物的造血分化，脂类代谢，激素分泌，癌症，糖尿病，白血病以及病毒感染等。,47,miRNA,靶基因 功能作用,lin-4 lin-14, lin-28,线虫早期时序发育,let-7 lin-41, RAS,线虫晚期时序发育,lsy-6 Cog-1,线虫神经系统发育,mir-273 Die-1,线虫神经系统发育,bantam Hid,果蝇细胞凋亡,mir-14,未知 果蝇细胞凋亡及脂类代谢,mir-430,未知 斑马鱼神经发育,mir-181,未知 小鼠,B,淋巴细胞分化,mir-375 Mtpn,小鼠胰岛素分泌,mir-15/16 BCL-2,人,B,淋巴细胞慢性白血病,mir-155,未知 人弥散性大,B,淋巴瘤,mir-17-92 E2F1,人,B,细胞淋巴瘤和肺癌,部分已知功能的,miRNA,引自 方福德, microRNA,的研究方法与应用,中国协和医科大学出版社, 2008,48,miRNA,靶基因 功能作用,mir-223 NF1A,人粒系分化,mir-23b Hes1,小鼠神经发育,mir-206 Connexin43,鸡骨骼肌发育,mir-125a/b ERBB2, ERBB3,调节原癌基因的表达,mir-1,未知 影响人脂肪基质细胞成肌潜能,mir-133a,未知 人肌细胞发育,mir-9a Sens,调节果蝇感官发育,mir-122,未知 人肝癌发生,续表,49,MicroRNA,的调控机制,mRNA,剪切,miRNA,与靶,mRNA,几乎完全互补；,切割位点在从,5,端起与,miRNA,配对的第,10,位和,11,位核苷酸之间 ；,由,RISC,中的内切酶催化完成；,可催化多个,mRNA,分子的降解,翻译抑制,miRNA,与靶,mRNA,互补程度较低；,翻译抑制可能发生在翻译起始后的某一阶段；,翻译顺利进行但翻译产物可能被特异性降解,每个,miRNA,可以有多个靶基因，而几个,miRNAs,也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个,miRNA,来调控多个基因的表达，也可以通过几个,miRNAs,的组合来精细调控某个基因的表达,50,MicroRNA,表达的研究方法,miRNA,基因芯片技术,，高通量检测,miRNA,表达情况的最佳选择；,PAGE/Northern blotting,杂交法,，可用于,miRNA,表达水平的定量检测，还能与,RNA marker,结合使用检测,miRNA,分子的大小，用来排除其他小分子,RNA,的污染；,原位杂交,，可直观显示生物体,miRNA,的时间和组织特异性表达谱；,miRNA,实时定量,PCR,，可高度灵敏地检测出低丰度表达地靶分子，适用于高通量筛选。,51,miRNA,功能研究的主要实验策略,引自,J Krtzfeldt, Matthew N Poy and Stoffel. Strategies to determine the biological function of miRNAS. Nature Genetics, 2006,38 (suppl):S14-S19,Dicer mutants,Global miRNA Knockout,Tissue/cells,miRNA identification,Phenotype,Gene expression profiling,miRNA overexpression,miRNA Silencing,Microarray gene expression,Target validation,Rescue,Phenotype,Phenotype,Phenotype,Disease model,miRNA profiling,Gene expression profiling,Normalize miRNA pro overexpression/silencing,Bioinformatics,52,MicroRNA,功能研究方法,miRNA,体外或体内水平的过表达研究,构建相应的表达载体,体外合成,miRNA,前体分子,miRNA,表达抑制研究,基因水平抑制,miRNA,表达,使用反义核酸分子抑制,miRNA,表达,53,miRNA,基因克隆,（一）基本原理：,miRNA,克隆是依赖于其本身的特殊结构，,5,端的磷酸基团和,3,端的羟基基团，以,T4 RNA,连接酶在分子末端加上连接子，然后利用,RT-PCR,方法扩增获得目的片段，克隆到合适的载体，最后测序验证。,（二）应用,：,microRNA,基因克隆主要用于寻找新,microRNA,基因，同时还可获得精确的表达信息。,55,Michael MZ, 2006,Total RNA,5 P,OH 3,PAGE size separation,5 HO,OH 3,Phosphatase,5 HO,T,4,RNA ligase,5 P,P 3,3 adapter,P 3,5 P,P 3,T,4,polynucleotide kinase,-OH 3,P 3,T,4,RNA ligase,P 3,Ban ,Ban ,5 adapter,RT-PCR,Ban ,Ban digest, religate, ligate into plasmid vector and sequence inserts,miRNA,基因克隆策略,56,miRNA,基因克隆的基本步骤,（一）总,RNA,的提取,关键：尽量不使小,RNA,丢失,（二）小分子,RNA,分离纯化及富集,变性聚丙烯酰胺凝胶（,PAGE,）方法 是用于小分子,RNA,分离纯化的理想方法。,（三）小分子,RNA,片段修饰,小分子,RNA,的修饰包括磷酸化、去磷酸化以及在,3,端和,5,端连接上连接子等,57,miRNA,基因克隆的基本步骤,（四）克隆及测序鉴定,含,3,与,5,端接头的小分子,RNA,，经,RT-PCR,扩增后连接至合适的载体，转化克隆，最后用相关方法鉴定阳性克隆。,（五）,PAGE/Northern blotting,验证,PAGE/Northern blotting,方法是确认,microRNA,最有效 和常用的方法。,58,PAGE/Northern blotting,（一）基本原理：,PAGE/Northern blotting,与常规核酸杂交技术原理相同，都是根据碱基互补配对原理，设计特异探针，与膜杂交，经放射自显影后分析杂交信号。唯一的差别在于选择对小分子,RNA,分离效率更高的,PAGE,代替琼脂糖作为分离胶。,（二）应用：,PAGE/Northern blotting,方法能提供准确的杂交信息以及有效检测低丰度的,RNA,分子，在验证,micorRNA,基因芯片结果及降低假阳性方面具有重要作用，是目前研究,microRNA,的重要技术。,59,PAGE/Northern blotting,基本操作步骤,（一）总,RNA,的提取,关键：尽量不使小,RNA,丢失,（二）样品处理,取适量提取的,RNA,样品于上样缓冲液及去离子甲酰胺中 混匀，,55,孵育,30 min,，冰浴后准备,PAGE,分离。,（三）,PAGE,分离、转膜及固定,60,PAGE/Northern blotting,基本操作步骤,（四）寡核苷酸探针的制备,探针标记可选择放射性核素或非放射性荧光，其中放射 性核素敏感度高，可检测较低丰度的,microRNA,分子,（五）杂交、洗膜、压片及显影,（六）如果选用放射性标记的探针，在分析结果后要去除,Northern,印记膜上的放射性，避免放射性污染。,61,MicroRNA,基因芯片技术,基本原理：,MicroRNA,基因芯片的基本原理与以往传统基因芯片的使用原理基本相同， 即经过标记的待测,microRNA,与芯片上特定位置的探针根据碱基互补配对原则杂交，再经特定仪器扫描，以计算机相关软件对荧光信号进行检测，并转化为可读的数字信息，最后经大量数据分析筛选出有显著表达差异的,microRNA,。,62,MicroRNA,基因芯片技术,主要应用：,（,1,）寻找和发现新,microRNA,基因；,（,2,）,miRNA,相关疾病的诊断和治疗，如肿瘤、 白血病、糖尿病等；,（,3,）药物筛选和药物开发等；,63,MicroRNA,基因芯片技术操作流程示意图,Li W, Ruan KC. 2009,64,MicroRNA,基因芯片技术操作流程,（一）,MicroRNA,基因芯片的设计与制作,可根据实验需要自行设计芯片，需要考虑探针的种类、点阵数目及片基种类等；也可向市面上购买芯片,（二）,RNA,提取与纯化,（三）,RNA,样品的标记,MicroRNA,芯片表达谱分析的一个前提条件是检测到所有的,microRNA,，并且结果具有可重复性。因此，选择合适的,microRNA,标记系统是实现芯片表达谱检测精确性的一个保证。,65,MicroRNA,基因芯片技术操作流程,（四）芯片杂交及后处理,由于,microRNA,分子量小，因此，杂交反应条件及杂交后洗脱条件需谨慎选择。,（五）图像采集和数据分析,MicroRNA,基因芯片图像的采集和分析是,microRNA,芯片技术的重要环节，芯片图象获取的准确性和分析的可靠性直接影响芯片的应用。,（六）验证,由于,microRNA,基因芯片结果存在假阳性的可能性，需要用,PAGE/Northern blotting,、定量,PCR,等方法验证。,66,MicroRNA,实时定量,PCR,基本原理：,利用能特异标记,PCR,产物的荧光物质，显示,PCR,产物的动态累积，得到,S,型的扩增曲线；假设该曲线的前期,PCR,符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度来间接比较初始模板的分子数。,最初，实时定量,PCR,被用于定量检测小,RNA,分子的前体表达；现在，经过方法改进可用于检测成熟小,RNA,分子的表达。,67,MicroRNA,实时定量,PCR,主要应用,：,（,1,）,microRNA,的定量检测，可精确检测出细胞或组织样品中特定微量的,microRNA,表达水平；,（,2,）由于该方法可以同时检测,microRNA,及其前体，因此，可以根据两者在不同发育阶段的表达差异情况来深入了解,microRNA,的起源和发生；,（,3,）应用于临床诊断和治疗等。,68,TaqMan MicroRNA,实时定量,PCR,示意图,5,3,microRNA,RT primer,cDNA,Forward primer,Reverse primer,Q,F,Real-time PCR,Reverse transcription,TaqMan probe,Chen CF, Ridzon DA, Broomer AJ, et al. Real-time quantification of microRNAs by stemloop RTPCR.,Nucleic Acids Res. 2005; 33(20): e179,69,MicroRNA,实时定量,PCR,操作步骤,（一）总,RNA,提取、小分子,RNA,的分离纯化及富集,（二）逆转录反应,MicroRNA,的逆转录反应与普通的针对,mRNA,的逆转录反应过程基本相似，但也有其特异之处，如它的逆转录酶的特异性等。,（三）实时定量,PCR,针对,microRNA,的实时定量,PCR,的热学反应条件要谨慎选择。,70,MicroRNA,与疾病,MicroRNA,与人类疾病包括肿瘤、糖尿病、炎症、心脏疾病、病毒感染等的发生密切相关。,MicroRNA,造成疾病发生的可能原因有：突变、基因表达失活、低效转录等原因造成的,microRNA,表达下调；启动子区域基因扩增或突变等原因造成的,microRNA,表达上调等。,71,microRNA,引发癌症的可能原因：,（,1,）,microRNA,与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的 ；,（,2,）许多,microRNA,的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域 ；,（,3,）与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对,microRNA,的表达失控,72,充当抑癌基因作用的,miRNA,:,miR-15a,和,miR-16-1 :,这两个,miRNAs,的缺失或下调，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。,mir-143,和,mir-145,:,在结肠癌中明显下调,充当癌基因作用的,miRNA,:,miR-21:,在胶质母细胞瘤中表达增加,miR-155,:,在,Burkitt,淋巴瘤、,Hodgkin,淋巴瘤等肿瘤中表达上升,肿瘤类别 表达变化趋势,microRNA ID,经验证的靶基因,肺癌 表达上调,miR-26a1,miR-21 TPM1,miR-24-1(miR-189),miR-17-92,miR-30a,miR-143 ERK5,miR-145,miR-188,miR-331,表达下调,miR-200b,Let-7 HMGA2, RAS,目前肺癌中已经表达分析及初步功能研究的部分,microRNA,74,MicroRNA,与糖尿病,MicroRNA,引发糖尿病的可能原因：,（,1,）,MicroRNA,参与胰岛素的合成分泌调节； （,2,）,MicroRNA,对血糖代谢起着直接或间接的调控作用；,（,3,）,MicroRNA,与脂质代谢密切相关；,75,已知功能的部分,miRNA,与糖尿病的关系,Amit K. Pandey, et al., 2009,76,miRNA,的综合信息网站：,http:/,77,免疫共沉淀技术,参考文献,1. Zhifa Shen, Anik St-Denis and Pascal Chartrand. Cotranscriptional recruitment of She2p by RNA pol II elongation factor Spt4-Spt5/DSIF promotes mRNA localization to yeast bud.,Genes and Development,2010, 24:1914-1926,2. Zhifa Shen, Nicolas Paquin1, Amlie Forget and Pascal Chartrand. Nuclear shuttling of She2p couples,ASH1,mRNA localization to its translational repression by recruiting Loc1p and Puf6p.,Mol.Bio.Cell,2009. 20, 2265-2275 .,RNA Visualization inside Cells- seeing is believing,Techniques to Label RNA,RNA PolyA binding proteins taged with Green Fluorescent Protein (GFP),Fluorescent In Situ Hybridization (FISH),MS2 coat protein (MCP) -MS2 binding sites (MBS) system,The RNA-binding protein She2p-GFP,P,200,VNSEEEFQTLSAAWHSILDGKLSALDEEF,230,She2p,GFP,Shen,et al,.,Mol. Biol. Cell. Vol.,20 (2009),FISH,（,Fluorescence In Situ Hybridization,）,Shen Z.,et al.,Mol. Biol. Cell,2009, 20(8): 2265-2275.,TATTTC,T,GAAGAACA,T,TCATTTAATAGAT,T,TACTCAGTATCTGGG,T,CTT (T modified with,CY3/CY5),Specific RNA labeled with the MS2 system,Valeria de Turris et al. (2009 ),ISBN: 978-3-527-31288-7,Advancements in Imaging Technologies,single-molecule imaging: Optical system to match the requirements for imaging single moving particles.,Including:,Acquiring images at rates as fast as, or faster than, the particle movements projected optically onto the capture chip,Applying a minimal amount of light to avoid phototoxicity and bleaching of the sample.,Maximizing the signal-to-noise ratio and tracking the particles in three dimensions (3D) and in time (4D imaging).,一、,FISH,（,Fluorescence In Situ Hybridization,）技术介绍,FISH,过程,制片,谢谢,