目的基因导入受体细胞2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章目的基因导入受体细胞,1,第三节 重组子的筛选,在重组,DNA,分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子,。,概念,克隆子,转化子,重组子,2,将摄取外源,DNA,分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为,克隆子,。,把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做,转化子（,导入外源,DNA,分子后能稳定存在的受体细胞称为,转化子,）,，,现在这两者有通用的趋向。,含有,重组,DNA,分子,的克隆子被称为,重组子,，,如果重组子中含有,外源目的基因,则又称为,阳性克隆子,或,期望重组子,。,经过各种方法将外源,DNA,分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为,克隆子的筛选,。,3,一、遗传表型直接筛选法,（一）根据载体选择标记初步筛选转化子,在构建基因工程载体系统时，通常在载体,DNA,分子中组装了一种或两种,选择标记基因,，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为,筛选转化子的依据。,4,一般的做法,是,:,将转化处理后的受体细胞接种在含适量,选择药物的培养基,上，在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。,5,常用的,选择标记基因,主要是：,抗性基因；,表达产物可以发光或使反应底物显色的基因,相应的选择条件,是：,可以,被抗性基因产物分解的抗生素,；,可以使基因产物发光的光线，或者是可以使基因产物显色的试剂。,6,选择培养基,是：,根据宿主细胞类型配置的培养基，对于,细菌受体细胞,而言，通常用,LB,培养基，,在,LB,培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。,选择物：,是由,载体,DNA,分子上携带的,选择标记基因,所决定。,7,（一）根据载体选择标记初步筛选转化子,（,1,）抗药性筛选,（,2,）插入失活筛选法,（,3,）插入表达筛选法,（,4,）显色互补筛选法,（,5,）利用报告基因筛选植物转化细胞,（,6,）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞,8,（,1,）抗药性筛选,9,10,正向选择方式,11,注意：,利用,含一种选择药物的选择培养基,无法区分重组子和非重组子，只能区分转化子和非转化子。,非转化子呈,Ap,s,、,Tc,s,转化子呈,Ap,r,、,Tc,r,/s,12,（,2,）插入失活筛选法,13,双抗药性筛选,双,14,15,（,3,）插入表达筛选法,利用外源目的基因插入特定载体后能,激活筛选标记基因的表达，,由此进行转化子的筛选。,有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连接上一段,负调控序列,，当,插入失活该负调控序列,时，其下游的筛选标记基因才能表达。,16,例如,pTR262,质粒载体，它由,pBR322,衍生而来，其,Tc,r,基因的上游,含有一段,噬菌体,DNA,的,CI,阻遏蛋白编码基因及其调控序列，,CI,基因表达的阻遏蛋白可以抑制,Tc,r,基因的表达。,当外源,DNA,片段,插入,CI,基因的,Hin d,或,Bgl,位点,上时，,CI,基因失活。,Tc,r,基因,因阻碍解除而得以,表达,，故阳性重组子为,Tc,r,表型。,质粒本身,因为,Tc,r,基因受阻碍为,Tc,s,表型,，当转化细菌涂布在,Tc,平板上时，只有含有外源,DNA,插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。,17,（,4,）显色互补筛选法,18,19,lacZ,基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的,-,半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为,-,互补,。,具有完整乳糖操纵子的菌体能转译,-,半乳糖苷酶,(Z),、,IPTG,和,X-gal,时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体,DNA,上组入,-,半乳糖苷酶基因（,lacZ),部分缺失的片段,(lacZ,),则重组,DNA,分子转化,lacZ,互补型菌落，会在含有,X-gal,和,IPTG,的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。,20,lac Z,是,-,半乳糖苷酶基因部分缺失的,DNA,片段，含,lac Z,的重组载体转化,lac Z,互补型菌株，,可转译,-,半乳糖苷酶,，在含有,X-gal,（,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-D-,半乳糖苷）和,IPTG,（异丙基,-,硫代半乳糖苷）,的培养基上使转化子成为蓝色菌落，,而,lac Z,互补型菌株本身为白色菌落,。当,lac Z,区插入外源基因后，再转化,lac Z,互补型菌株，由于不能翻译,-,半乳糖苷酶，转化子即使在含有,X,gal,和,IPTG,的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。,此方法主要用于原核生物。,21,互补的检测,22,23,以显色剂,x-gal,作为选择物时,:,DNA,对照组,不应出现任何菌落；,感受态细胞对照组长,出的菌落应全是蓝色的；,感受态细胞有效性对照组长,出的菌落中应有白色的。,其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。,24,（,5,）利用报告基因筛选植物转化细胞,报告基因：,系指,其编码产物,能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。,在,植物转基因,研究中，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成,嵌合基因,，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列,。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等,。,25,特征,作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：,(1),已被克隆和全序列已测定；,(2),表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；,(3),其表达产物能进行定量测定。,26,新霉素磷酸转移酶基因（,npt,）,抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和,G418,等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。,潮霉素磷酸转移酶基因（,hpt,）,赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。,潮霉素是致癌物质，操作时应慎重,。,氯霉素乙酰转移酶基因（,cat,）,也被用于筛选动植物转化子的标记基因。,27,-,葡萄糖酸酶基因（,gus,）,gus,的基因产物,-,葡萄糖酸酶,（,GUS,）,能够催化,4-,甲基伞形花酮,-D-,葡萄糖苷酸，,产生荧光物质,4-,甲基伞形花酮，以此筛选含,gus,基因的转化子。,由于植物细胞,GUS,本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。,尤其是,gus,基因的,3,端与其他结构基因连接产生的,嵌合基因,仍能正常表达，产生的,融合蛋白,中仍有,GUS,活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。,28,萤火虫荧光素酶基因（,luc,）,luc,表达产物,萤火虫荧光素酶（,LUC,）在,Mg,2+,的作用下，,可以与荧光素和,ATP,底物发生反应，,形成,与酶结合的,腺苷酸荧光素酰化复合物，,经过氧化脱羧作用后，,该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用,荧光测定仪,快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。,Luc,基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，,Luc,是,一种理想的报告基因,。,29,抗除草剂,bar,基因。,bar,基因编码磷化乙酰转移酶（,PAT,），使转化子对含有磷化麦黄酮（,PPT,）成分的除草剂具有抗性。,冠瘿碱合成酶基因。,主要包括,胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因,两类，存在于土壤农杆菌,Ti,质粒的,T-DNA,区段。,冠,瘿,碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。,冠,瘿,碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。,30,（,6,）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞,在植物转基因研究中采用的,氯霉素乙酰转移酶,(Cat),基因和新霉素磷酸转移酶,(Npt),基因,也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。,常用的标记基因还有：,-,胸腺核苷激酶基因（,tk,）、,-,二氢叶酸还原酶基因（,dhfr,）,-,次黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（,hgprt,）,-,细菌的黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因,(ecogpt),等。,31,胸腺核苷激酶基因（,tk,）、二氢叶酸还原酶基因（,dhfr,）及次黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（,hgprt,）等的,表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。,这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。,如果用这样的,缺陷型细胞作为受体细胞,，导入含有上述基因的外源,DNA,，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以,在不添加核苷酸的培养基,中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。,32,三、核酸分子杂交检测法（,p239,）,基本原理,复性,RNA,DNA,33,待测的核酸序列,杂交的双方,用于检测的已知核酸片段,探针,34,35,根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同。,Southern,印迹杂交,Northern,印迹杂交,斑点和狭线印迹杂交,菌落（或噬菌体）原位杂交,核酸分子杂交检测法分类,36,又称,DNA,印迹杂交、,Southern DNA,印迹杂交,1,、,Southern,印迹杂交,经琼脂糖凝胶电泳分离的,DNA,片段,转移到滤膜上,与标记的,DNA,或,RNA,探针杂交,放射自显影显杂交带,基本原理：,37,（,1,）提取总,DNA,（,2,）酶解,（,3,）电泳,（,4,）转印,（,5,）变性解链,（,6,）杂交,（,7,）洗脱,（,8,）放射自显影,（,9,）比较分析,38,毛细管虹吸印迹法,电转移印迹法,真空转移法,核酸转移（印迹）方法,39,毛细管虹吸印迹法,湿滤纸,高盐缓冲液,滤纸桥,凝胶,硝酸纤,维素膜,吸水纸,玻璃板,支持台,容器,重物,40,利用核酸分子在电场中的,电泳作用,将凝胶中的,DNA,转移到固相支持物上。,湿式电转移,干式电转移,电转移法,41,尼龙膜,凝胶,滤纸,海绵,凝胶支持夹,缓冲液,电极,+,滤纸,电极,湿式,电转移法,42,真空转移法,43,真空转移装置,44,硝酸纤维素膜,（简称,NC,膜）,优点：,吸附能力强，杂交信号本底低,缺点：,DNA,分子结合不牢固，膜易碎裂，依赖高盐溶液,常用的固相支持物,45,尼龙膜（,Nylon,）,优,点：,结合单链，双链,DNA,的能力比,NC,膜强，韧性高，可重复杂交,缺点：,杂交信号本底高,常用的固相支持物,46,凝胶,滤膜,转移,RNA,至膜上,RNA,分子,甲醛变性电,泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）,带有,RNA,片段的凝胶,转膜,杂交,、,显影,2,、,Northern,印迹杂交,47,两种印迹技术的比较,(P248),1234,48,3,、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,两种方法的,基本原理,和,操作步骤,相同,即通过特殊的,加样装置,将变性的,DNA,或,RNA,核酸样品，,直接转移,到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性,DNA,或,RNA,。,49,斑点杂交法,50,狭缝式点样器,51,1,、斑点印迹为圆形,2,、狭缝印迹为线状,3,、鉴别,DNA,、,RNA,4,、简单、快速，同一张膜可检测多个样品,5,、特异性不高、不能鉴别核酸分子量,斑点及狭缝印迹杂交的特点,52,4,、菌落（或噬菌斑）原位杂交,基本原理,直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上,溶菌、变性,DNA,暴露并于滤膜原位结合,与探针杂交,53,溶菌、使,DNA,暴露,洗菌体碎片和,Pr,使单链,DNA,牢固结合在膜上,54,操 作,用 途,Southern,印迹杂交,从转化子中提取总,DNA,，经酶切、电泳分带及变性，转移膜上，再用,DNA,探针与其杂交。操作麻烦。,鉴定转化子中,是否,含有,待检测重组,DNA,分子；,鉴定待检测的,DNA,分子的,大小,。,斑点印迹杂交,把提取的转化子总,DNA,直接点样到膜上，变性处理后再用,DNA,探针与其杂交。操作简单。,只能区别总,DNA,中,是否含有,待检测重组,DNA,分子的重组子,菌落（或噬菌斑）原位杂交,直接把菌落或噬菌斑印迹转移到膜上，经溶菌和变性处理后使,DNA,暴露出来并与滤膜原位结合，再用,DNA,探针与其杂交。操作简单。,广泛地用于从,基因组,DNA,文库,和,cDNA,文库,中筛选含目的基因的重组子。,三种筛选方法的比较,55,杂交探针,指具有一定序列的核苷酸片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，并且通过适当标记进行检测。,5,、核酸杂交探针,(,自学,),56,同源或部分同源探针,总,cDNA,探针,特异性,cDNA,探针,人工合成的寡核苷酸探针,（,1,）核酸杂交探针的种类,57,理想的探针标记物应满足的条件：,1),不会影响探针的主要理化性质；,2),检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；,3),操作简便、省时经济实用：,4),化学稳定性高、易于长期保存；,5),安全、无环境污染。,常用于分子杂交的探针标记物分,放射性,及,非放射性。,（,2,）探针标记物,58,放射性标记物,是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的产物，常见的放射性同位素有,32,P,、,3,H,、,35,S,、,14,C,、,125,I,等，其中以,32,P,、,3,H,、,35,S,最为常用。,标记物放射性的检测主要使用,盖革计数器,和,液体闪烁计数器,等,射线探测仪,来完成。,放射性标记物,59,非放射性标记物的最大优势是,无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，,但与放射性探针相比，,多数非放射性探针的敏感性及特异性较差,。,目前已广泛应用的非放射性标记物有：,生物素,(biotin),标记的核苷酸、,地高辛,(digoxigenin),标记的核苷酸,荧光素,(fluorescein),标记的核苷酸,非放射性标记物,60,（,3,）探针标记方法,探针的标记有,体内标记,及,体外标记,两种方法。,体内标记法,是以标记化合物作为代谢底物，通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核酸分子标记，例如在培养基中加入,3,H-,胸苷，就可以标记到生长在该培养基中的活细胞,DNA,分子上。,体内标记法受多种因素的限制，且标记活性不高，一般很少使用。,61,体外标记,包括,化学法,和,酶法,两种。,化学标记法,是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种基因,(,如磷酸基团,),发生化学反应而直接将标记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制备,非放射性标记物,的探针。,酶标记法则,是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸探针。,酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部分非放射性标记探针,。,常用的酶法有,DNA,缺口平移标记法、,DNA,随机引物标记法、,DNA,末端标记法,及,PCR,标记法,等。,62,切口平移标记法,(nick thanslation labeling),DNA,聚合酶,63,该法标记模板链,64,随机引物标记法,(random primed DNA labeling),Klenow,片段催化,该法标记模板互补链,随机引物,是含有各种可能排列的寡核苷酸片段的混合物。,65,随机引物：,4,6,使用随机引物标记的探针一般长,400-600,个核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。,与切口平移法不同的是，该方法标记的是模板互补链，而非模板本身。,66,末端标记法,(DNA terminal labeling),该法标记的是线性,DNA,或,RNA,的,5,端或,3,端，属非均一性标记。,1)3,凸出末端的加尾标记法：,末端脱氧核苷酸转移酶将带有标记的,dGTP,或,dCTP,加到,DNA3,-OH,端,2),双链,DNA3,隐蔽末端的填充标记,：（若反应体系存在全部与模板序列互补的,dNTP,）以凸出序列为模板，,Klenow,酶或,T4DNA,连接酶催化补平,3,末端（若一种,dNTP,带标记则成为探针）。,3)5,末端标记,：,T4,多聚核苷酸激酶将,ATP,的标记的,-,磷酸基团转移到游离的,5,-OH,上。,67,PCR,标记法,(PCR labeling),：标记的一种,dNTP,光敏标记法,化学衍生结合标记法,：,生物素和地高辛等非放射性标记物可以与事先经过化学修饰得到的核酸衍生物更加牢固地结合，进行非放射性探针的制备。常用的化学修饰反应包括磺化、转氨、溴化等反应类型,。,交叉相连标记法：,利用一些高分子化合物，如细胞色素,c,、组蛋白,H1,及大肠杆菌单链结合蛋白质等能与核酸结合的特性，制备相应的探针。,68,四、,DNA,序列测定法（录像）,DNA,序列测定，即核酸一级结构的测定，简称,DNA,测序。,对克隆,DNA,片段进行序列测定及分析,:,可以直观地鉴定出重组,DNA,分子中是否含有目的基因,;,可以获得目的基因的编码序列和基因调控序列,.,这对目的基因的表达及其功能研究具有重要意义。,69,DNA,序列分析,目前用于测序的技术主要有,:,Sanger,等（,1975,）发明的,双脱氧链末端终止法,Maxam,和,Gilbert,（,1977,）发明的,化学降解法。,这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生,A,，,T,，,C,，,G,四组不同长度的一系列核苷酸，然后在,尿素变性的,PAGE,胶,上电泳进行检测，从而获得,DNA,序列。,目前,Sanger,测序法得到了广泛的应用。,70,1 DNA,的化学降解测序法,DNA,的化学降解测序,法,也叫,Maxam-Gilbert,测序法,基本原理,是，将待测,DNA,分子进行末端放射性标记，然后置于,4,组独立的化学反应体系中分别进行部分降解，其中每一组反应特异性地针对某一碱基或某一类碱基。通过化学降解一段时间后，在每一组反应体系中，生成各种不同长度的、一端为放射性标记固定的寡聚核苷酸分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测,DNA,分子的碱基序列。,71,（,2,）碱基切割反应体系,进行碱基特异性化学切割反应的试剂是硫酸二甲酯、肼（联氨）以及哌啶（六氢吡啶）。,硫酸二甲酯,、,肼（联氨）,碱基进行化学修饰；,哌啶,从修饰碱基处断裂核苷酸链。,在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同的组合能特异地切割核苷酸序列中的特定碱基，降解待测模板,DNA,分子。,72,硫酸二甲酯（,DMS,）：,G,；,pH2,甲酸哌啶：,G+A,;,肼（,NH2NH2,）：,C+T,;,肼（,NH2NH2,）,+,高盐：,C,73,1,、待测模板的制备,3,、待测模板,DNA,分子的序列分析,2,、化学降解待测模板,DNA,分子,测序步骤,（,3,）,DNA,74,序列的读取是,逆电泳方向,进行的,DNA,75,化学降解测序法不仅适于,单链,DNA,，,也适于,双链,DNA,的测序，主要用于研究,DNA,的一级和二级结构、,DNA,甲基化位点测定和,DNA-,蛋白质相互作用等方面，结果准确可靠，是,DNA,测序的基本方法之一。,它的,缺点是一轮反应所能测定模板,DNA,长度只有,250bp,左右，若测定大片段,DNA,分子时，操作较为繁琐费时。,另外，化学降解测序法,不能在载体上直接进行，,标记后的模板,DNA,分子难以纯化。,76,2 DNA,的双脱氧链终止测序法,双脱氧链终止测序法是由,Sanger,等在加减法的基础上建立的一种简单快速的,DNA,序列分析法，故也称为,Sanger,测序法,。有时又称为,引物合成法,，或,酶促引物合成法,，因为该法是以待测,DNA,分子为模板，在,DNA,聚合酶,的作用下，利用适当的,DNA,合成引物进行,DNA,互补链的合成,来完成测序工作的。,77,基本原理,：,DNA,聚合酶能够利用单链,DNA,作模板，合成出对应的,DNA,互补链，但在反应过程中，如果,2,，,3,-,双脱氧核糖核苷三磷酸底物,（,ddNTP,）掺入到寡核苷酸链的,3,端，,DNA,链的延伸反应即被终止。,ddNTP,链终止核苷酸,（,1,）基本原理,78,79,80,在,4,个特定反应体系中,分别加入一种,ddNTP,反应底物（,ddCTP,、,ddATP,、,ddGTP,、,ddTTP,）以及,DNA,模板、合成引物、,DNA,聚合酶,I,、一定浓度的,dNTP,（,dCTP,、,dATP,、,dGTP,、,dTTP,，其中有一种是带,32,P,放射性标记的），,DNA,链的合成随机终止于某一特定,ddNTPs,。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影技术读出待测,DNA,模板的碱基序列。,双脱氧链终止测序法的精确度较高，绝大多数以单纯测定,DNA,序列为目的的实验室均采用此法。,此法读取的碱基序列是待测,DNA,模板的互补链，而非模板链本身。,81,ddNTP,82,83,84,85,（,2,）双脱氧核糖核苷三磷酸的作用机制,2,，,3,-,双脱氧核糖核苷三磷酸（,ddNTP,）的分子结构式与,2,-,脱氧核糖核苷三磷酸（,dNTP,）极为相似，惟一的区别是，,ddNTP,在脱氧核糖的,3,位置上缺少一个羟基。,在,DNA,链的合成过程中，,ddNTP,可以利用其,5,-,磷酸基团与,DNA,链上的游离羟基基团形成磷酸二酯键而使链得以延伸，但是由于,ddNTP,缺少,3,-0H,基团，不能与下一个底物分子的,5,-,磷酸基团进行反应，因此新生的寡核酸链一旦加入,ddNTP,，,DNA,链的合成就会终止。,86,87,（,3,）待测模板,DNA,分子的制备,限制性核酸内切酶消化切割形成,DNA,小片段,随机地克隆到一种合适的载体分子上,经转化筛选后得到含有同一来源,DNA,片段的重组子克隆后代,以此大量制备重组,DNA,分子，直接用于,DNA,测序需要,采用,DNA,分子克隆,的方法制备模板,DNA,：,88,因为新生,DNA,链的合成反应是从引物,3,端定向进行的，无须将待测,DNA,片段从载体上切下。,事实上，载体的存在不但不会影响测序的结果，反而有利于测序的进行，因为在实际操作中，,引物往往是与载体克隆位点的两侧序列互补,，这样可以测定完整的,DNA,序列。,89,M13,载体,能克隆单链,DNA,分子，制备的产物可直接用作引物合成反应中的单链模板，同时，由于待测,DNA,片段均被克隆在,M13,载体的同一个特定区段内，,所有的待测,DNA,片段，都可以使用同一种引物，即,M13,载体克隆位点两侧的通用引物（,universal primer,）进行,DNA,链的合成延伸,，避免了因合成和分离各种不同引物而导致的许多麻烦。,因此，,M13,载体双脱氧链终止法目前已经成为一种普遍采用的快速,DNA,序列分析法。,90,1985,年,Chen,和,Seeburg,为了提高,DNA,测序速度建立。,该法是将待测定的,DNA,片段克隆到质粒载体上，直接用,闭合环形的双链质粒,DNA,按双脱氧链终止法测定模板,DNA,序列。由于通常使用的质粒是,PUC,载体系列，所以又称之为,Sanger,双脱氧链终止,-pUC,体系,DNA,序列分析法。,这种方法的最大,优点,是，它无须将,DNA,克隆到,M13,载体分子上，而是直接用碱变性的双链闭合环形的重组质粒,DNA,作为模板进行序列分析，因此比,M13,法更为简单快速，实用价值高。,针对双链,DNA,模板进行的双脱氧链终止测序法,91,（,4,）测序反应物的合理应用,双脱氧链终止测序法的,操作关键,：是,ddNTP,与,dNTP,的用量比例,，两者较为理想的分子比在,1,：,3,至,1,：,4,之间。,大肠杆菌,DNA,聚合酶,Klenow,片段、测序酶（经过改造的,T7,噬菌体聚合酶）、,TaqDNA,聚合酶,DNA,序列分析中通常采用,-,35,S,dATP,代替,-,32,P,dNTP,，以便获得更高的分辨率。,92,3,大片段,DNA,的测序策略,DNA,测序通常包括,克隆、测序反应和读序,三个步骤。,前述两种,DNA,测序方法中，一次测序能直接读出的,DNA,序列长度受到,聚丙烯酰胺凝胶分离效果,的限制，一般情况下，最大限度不超过,350,个碱基序列。因此，对于较大的,DNA,片段而言，必须将其分成较小的片段分别测序，才能获得完整的碱基序列。,选择,恰当的测序策略,将直接关系到大片段,DNA,或基因组,DNA,序列分析的工作效率。,93,随机克隆策略,又叫,鸟枪法克隆策略,，先将克隆,DNA,片段用超声波打断或,DNA,酶,切断，随机亚克隆到,M13,载体上，分别进行,DNA,序列测定，然后利用计算机进行数据分析，排出完整的,DNA,序列。,鸟枪法的缺点,随机亚克隆易造成序列重复测定，也易丢失某些序列；,测序及测序后的数据处理和分析工作量大，并需要计算机帮助进行排序才能得到完整的序列。,94,95,引物步移策略,将待测,DNA,片段克隆在,质粒载体,上，利用引物步移延伸，从,DNA,片段的一端开始逐步进行序列测定，直到另一端为止。,96,97,引物步移法克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备的繁琐步骤，也减轻了随后数据分析的工作量。,但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基序列，才能合成适当的引物进行测序，因此,该策略难以自动化操作,。此外，引物合成费时费力，再加上目前常用的,质粒载体不易纯化,等也都影响了该法的实施。,最近的研究表明,：随机引物,可作为引物步移法中的测序引物，例如采用线性连接的,3,条,6,碱基的随机引物即可很好地引导测序反应，这些结果为引物步移法的自动化带来可能。,98,定向缺失克隆策略,利用核酸外切酶,、,Bal31,或,T4 DNA,聚合酶等酶解方法，从克隆,DNA,片段一侧进行,不同时间的定向缺失，逐步缩短,DNA,片段大小，分别回收并环化,DNA,缺失片段，使,DNA,片段被保护一侧的引物结合位点与缺失不同长度的一侧连接重组，转化筛选后得到一系列由待测,DNA,片段定向缺失后形成的嵌套重组子，然后利用引物结合位点逐一测定这些嵌套重组子中的待测,DNA,模板，最后根据重叠序列将不同片段的序列拼接为完整的,DNA,片段序列。,99,利用,Exo,能特异性起始切割,5,凸出端或平末端的双链,DNA,，而不能有效切割,3,凸出端的双链,DNA,的特性，构建待测,DNA,的,定向,嵌套缺失。,100,4,、,DNA,测序技术的发展,第一，非放射性标记检测物的使用,第二，,DNA,测序自动化：,1,是测序过程中某些具体 步骤的机械化和自动化，,2,是高度集成的自动化测序仪的发明及应用,第三，计算机在,DNA,测序中的应用：,大规模测序计划在很大程度上依赖于计算机程序对原始数据进行分类、整理和排序，尤其是在随机测序策略中，采用计算机辅助分析，大大加快了,DNA,测序的发展进程。,101,第四，现有技术的其他改进。,主要包括：,增加每块胶上的泳道数；,采用新型凝胶和电泳技术；,改进光学检测系统；,提高测序聚合酶的催化效能等。,其目的是大大加快测序速度，提高测序反应的灵敏度及准确性，降低测序反应对模板质量的要求，简化模板制备程序等。,102,DNA,测序方法分为两类：,一类是基于凝胶电泳技术的测序法,，包括目前普遍采用的手工,DNA,测序技术、自动化,DNA,测序技术、毛细管凝胶电泳激光荧光法、阵列毛细管电泳激光荧光法和超薄层凝胶板电泳激光荧光法等；,另一类是不依赖于电泳分离的直接测序法,，包括质谱法、原子探针法、杂交法和流动式单分子荧光检测法等。,103,（,1,）以凝胶电泳为基础的测序方法,DNA,全自动序列分析系统（,ALF system,）,DNA,自动测序,采用,荧光,替代放射性核素标记是实现,DNA,序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行,Sanger,测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小,DNA,片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定,DNA,碱基的排列顺序。,104,超薄层板凝胶电泳（,ultra-thin gel electrophoresis,，,UGE,）激光荧光法,在,电泳方式方面,有,2,处改进：,1,是超高压电场的使用，它可以大幅度提高电泳速度；,2,是超薄凝胶的使用，由于降低了凝胶厚度，不仅提高了电泳速度，还可以提高电泳条带的分辨率，使一次性阅读由原来的,500,个碱基上升至,1000,个碱基，总的效果是测序速度提高到,8000bp,h,以上。在,电泳结果检测方式,方面，以激光荧光检测法取代了传统的放射自显影检测法，既杜绝了放射性核素带来的危害，也便于自动化操作。,105,PCR,测序技术,第一，利用,PCR,技术直接从大的,DNA,片段或基因组,DNA,中扩增获得足够量的待测,DNA,模板，从而省去亚克隆等繁琐步骤。目前，不对称,PCR,、单链,PCR,、固相,PCR,以及循环,PCR,等新的,PCR,技术都已应用到,DNA,测序中。,第二，通过,PCR,技术进行重叠群排序。将由重叠群末端序列确定的引物逐一配对，以待测大片段,DNA,为模板进行,PCR,，如能扩增出阳性条带，便说明这两个重叠群相邻。重叠群顺序一经确定，便可利用,PCR,扩增重叠群间的,DNA,片段。,第三，利用,PCR,技术进行,DNA,链终止测序反应，这一过程被称为,循环测序,。循环测序是在模板,DNA,分子过少时，用耐高温的,Taq,酶代替,DNA,聚合酶进行酶法测序。在测序反应中，一方面模板,DNA,分子得以扩增，另一方面,ddNTP,的插入造成以特定,ddNTP,结尾的长短不同的,DNA,片段。通过电泳分离便可获得待测,DNA,分子的碱基序列。,循环测序的优点,有：大大减少了模板,DNA,的用量；重复的变性、复性、链延伸循环可使双链,DNA,的酶法测序高效进行；初始阶段加入试剂后不必在中途补充，可实现自动化。,106,毛细管及阵列毛细管电泳激光荧光法,与普通凝胶电泳相比，毛细管凝胶电泳具备很多优势：,第一，高效、快速。毛细管内径一般在,25,100pm,，比表面积大，散热快，可使用较高的电场强度，大大提高了分析速度和分辨率。,第二，所需样品量少，灵敏度高。采用电动进样或压力进样，样品量仅为,1-50ul,，普通紫外检测器可检测,10,-13,-10,-15,mol,，激光诱导荧光检测可达,10,-18,-10,-21,mol,。,第三，在线检测。利用检测窗口直接进行柱检测，不受凝胶长度的影响。,第四，操作自动化、重复实验误差低。,因此，利用毛细管凝胶电泳进行,DNA,测序，分辨率极高，其关键在于选择合适的毛细管长度、电场强度、凝胶聚合物浓度及温度因素等，以达到将一个碱基大小差异的,DNA,片段顺利分离开来的目的。,107,（,2,）非电泳分离的测序技术,杂交法（,SBH,）,SBH,的基本原理是，用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸群体，与未知序列的特点数目的,DNA,片段杂交，根据某些寡核苷酸探针形成的完全双链推知目的,DNA,的碱基序列。,108,利用共价结合在寡核苷酸,3,或,5,端的衍生物与玻璃板或凝胶结合，形成固定的,寡核苷酸小区,；不同碱基组合的寡核苷酸小区排列在一起形成,探针点阵,，构成,DNA,测序芯片,或称为,基因芯片、寡核苷酸矩阵芯片,。芯片中寡核苷酸小区的数目取决于寡核苷酸片段的长度，以八聚体单链,DNA,探针为例，包含所有可能的,4,种碱基的全部排列序列共计,4,8,=65536,种，因此在芯片上寡核苷酸小区数目为,65 536,个，,每一个寡核苷酸小区则代表了一个已知序列的探针。,每一个探针序列与其所处位置的对应关系是已知的，测序时，只须将待测,DNA,样品变性解链，在单链,DNA,片段末端上共价标记一个,荧光分子,，然后与基因芯片进行复性杂交。经适当清洗后，与探针完全杂交的单链,DNA,的荧光分子在特定波长的激光束照射下，发射出一定波长的荧光，然后再由,荧光扫描仪,将基因芯片上的所有方格点阵进行荧光扫描检测，并将荧光发射与否的正负信号传输到电脑，最后根据发射荧光的探针序列排出待测,DNA,样品的全序列。,109,110,原子探针显微镜法,扫描隧道显微镜（,STM,）和原子显微镜（,AFM,）,等新技术的发展，使快速、高分辨、直接观测,DNA,分子构象成为可能。,STM,采用了相当于原子直径的导电探针扫描样品表面，通过连续测量移动的探头与分子表面之间形成的隧道电流，确定样品的三维图像。,AFM,则是通过测量探针和,DNA,样品表面的作用力来确定分子表面形状，并不要求样品导电。,目前，应用,STM,已成功地观测到,DNA,双螺旋结构和单个碱基对以及单链分子中的单个核苷酸，因此可以直接从,DNA,单链上读取碱基序列。根据扫描速度，,DNA,测序能力可达,1000bp,min,以上。,111,流动式单分子荧光检测法,美国,Los Alamos,国家实验室建立的一种快速,DNA,测序新技术，可对单个分子进行检测。,基本原理是，对模板,DNA,片段上的,4,种碱基分别标记上不同的荧光基团，然后置于液体系统中，用水流载带,DNA,片段流动，利用外切酶快速逐个地切断,DNA,中标记的单个碱基，通过激光荧光检测碱基类型，便可得到模板,DNA,序列。,据报道，此法测序速度可达,100,1000bp/s,，而常规的自动测序仪最快的阅读速度仅为,0.1bp/s,。,存在的主要问题是如何快速酶切单个荧光标记的核苷酸分子以及如何用,4,种不同的荧光基团标记不同的,4,种碱基等。,112,基本过程与菌落分子杂交法相似，但该法使用,抗体探针,，而非,DNA,探针来鉴定目的基因表达产物。,免疫学检测法,具有专一性强、灵敏度高的特点，只要有一个拷贝的目的基因在克隆子细胞内表达合成蛋白质，就可以检测出来。,前提条件,是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。,根据实验手段的不同，免疫学检测法可以分为,抗体测定法,和,免疫沉淀测定法,等类型。,四、免疫化学检测法（自学）,113,（,1,）放射性抗体测定法,（,2,）非放射性抗体测定法,1,、抗体测定法,114,基本依据,一种免疫血清中含有多种类型的免疫球蛋白,IgG,分子，这些,IgG,分子分别与同一抗原分子上不同的抗原决定簇特异性结合。,抗体分子或其某部分可牢固地吸附在固体支持物（如聚乙烯塑料制品）的表面上，因此不会被洗脱掉。,通过,体外碘化,作用，,IgG,抗体会迅速地被放射性,125,I,标记上。,（,1,）放射性抗体测定法,115,放射性抗体测定法的操作过程,116,目前所采用的免疫学检测方法中，更多的,是先将待检测的菌落或噬菌斑按原位印迹到硝酸纤维素膜等固相支持物上，然后裂解细胞，使目的蛋白抗原结合到硝酸纤维素膜上，进一步与相应的抗体（即第一抗体）反应，形成抗原,-,抗体复合物。,对抗原,-,抗体复合物的检测，既可采用,125,I,标记的,第二抗体,直接检测，也可采用,125,I,标记的,A,蛋白,进行间接分析。,直接检测法,中，针对不同的第一抗体，应分别标记相应的第二抗体进行检测；,间接分析法,中，只须标记一种,A,蛋白分子便可检测多种不同的第一抗体（,A,蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种组分,，它可以牢固地结合到,IgG,分子的,Fc,段，形成多分子复合物）因此用一种碘化标记试剂可以检测筛选产生不同抗原的重组克隆子，而不必每次标记不同的第二抗体。,117,118,119,120,121,（,2,）非放射性抗体测定法,非放射性抗体分析技术的发展得益于非放射性标记物的广泛成功的应用。,可以采用直接与,辣根过氧化物酶（,HRP,）,或,碱性磷酸酶（,AP,）,偶合的第二抗体，检测目的蛋白抗原,-,抗体复合物。也可采用与,HRP,偶联的抗生物素蛋白来检测与生物素偶联的第二抗体等。这些方法也称为,酶联免疫检测分析法（,ELISA,），,具有较高的灵敏度和特异性，也没有使用放射性核素标记物带来的半衰期短和安全防护等问题。,122,123,124,125,126,2,、免疫沉淀测定法,在生长有转化子菌落的培养基中，加入与目的基因产物相对应的标记抗体。如果菌落会产生与抗体相对应的抗原蛋白（目的基因产物），则其周围就会出现一种叫,沉淀素,的抗体,-,抗原沉淀物形成的白色圆圈。该方法操作简便，但灵敏度不高，实用性较差。,127,128,五、转译筛选法（了解）,转译筛选法，分为,杂交选择转译,（,hybrid selected translation,）和,杂交抑制转译,（,hybrid arrested translation,）。,其突出优点在于将克隆的,DNA,同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。,129,1,、杂交抑制转译检测法,原理是，在体外无细胞的转译体系中，目的基因的转录产物,mRNA,一旦同,DNA,分子杂交之后，就不再能够指导蛋白质多肽的合成。,从转化子菌落或噬菌体群体中制备,质粒,DNA,，变性后选择有利于形成,DNA-RNA,杂种分子,，但不利于形成,DNA-DNA,杂种分子，同时又能阻止线性质粒,DNA,再环化的反应条件，与,原菌落或噬菌体群体的总,mRNA,进行杂交,。,从杂交混合物中回收核酸，,进行体外转译。由于体系中加有,32,S,标记的甲硫氨酸，因此转译合成的多肽蛋白质，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析。,把其结果同未经杂交处理的,mRNA,的转译产物作比较，若杂交组缺少某种蛋白质（被杂交抑制了的,mRNA,的产物），表明供杂交用的那部分克隆子群体中含有目的基因。,然后，将这个群体分成若干较小的群体，并重复上述实验程序，直至最后鉴定出含目的基因的单一克隆子。,130,如果被研究的目的基因能编码丰富的,mRNA,，采用杂交抑制转译检测法筛选阳性克隆子尤为适合。,常用的无细胞转译体系包括麦胚提取物和网织红细胞提取物等，系统中包含了基因表达所需要的所有因子，如,RNA,聚合酶、核糖体、,tRNA,、核苷酸、氨基酸以及合适的缓冲液组成成分。,131,2,、杂交选择转译检测法,杂交选择转译法，有时也称,杂交释放转译法（,hybrid released,translation,），,比杂交抑制转译法灵敏度更高的阳性重组子筛选法，适用于低丰度,mRNA,产物的,cDNA,重组分子的检测。,与杂交抑制转译法不同，杂交选择转译法是通过杂交手段选择目的,mRNA,进行体外转译，而非抑制目的,mRNA,的体外转译。,132,基本做法,是从克隆文库中挑取转化菌落或噬菌体群体，分离制备其,质粒,DNA,分子,，经适当处理后,牢固结合在硝化纤维素滤膜上,。,然后用同一菌落或噬菌体群体的,mRNA,（甚至是总的细胞,RNA,）进行杂交。,通过洗脱作用，分离出能与结合的,DNA,分子杂交的,mRNA,。,回收杂交的,mRNA,，加到无细胞体系中进行体外转译，通过凝胶电泳分析或根据生物活性鉴定转译合成的带放射性标记的多肽产物。,一旦获得某种呈阳性反应的克隆群体，可将它分成许多小库，直到用划线培养法获得一个或数个呈阳性反应的单菌落重组子为止。,133,Thank You !,134,