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Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,1,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物制药工艺学,Biopharmacetical Technology,第七章 亲和层析,Affinity Chromatography,亲和层析,( Affinity Chromatography, AC),亲和层析的,基本概念,亲和层析,载体,的性质与选择,亲和层析,配基,的性质与选择,载体、配基、目的物的,连接,（难点）,亲和层析的,基本操作,(,重点）,第一节： 亲和层析（,Affinity,Chromatography,）的基本概念及特点：,一、 基本概念：,(basic concept),：,1,：,亲和层析,是利用待分离物质与其特异性配基之间,特异性的亲和力,进行分离的一类特殊的层析技术,.,Typically offers purities,95%,in one step.,2,： 配基（,ligand,） ：,被固定在基质上的分子称为配基，配基和基质是以共价键结合的。,3,：,基质（,matrix):,亦称为载体（,vector):,是,构成固定相的骨架 。,二：亲和层析有如下特点：,(,Characteristics of,Affinity Chromatography),1:,纯化,过程简单,、迅速,.,2:,分离,效率,高。,3:,产物,纯度,高。,4:,必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。,因此应用范围受到一定的限制。,三：亲和层析的基本原理,(Mechanism of Affinity Chromatography),1,：亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为,固定相吸附剂,。,2,：当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出。,3,：然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。（见,Fig1,、,Fig2),。,( Fig1. Mechanism of AC),( Fig2. Mechanism of AC),具有特异性亲和作用的生物分子,四：配基的种类,:(sorts of ligand),1,：抗原与抗体。,2,：,DNA,与互补,DNA,或,RNA,（,cDNA,、,mRNA),。,3,：酶与其底物。,4,：激素与其受体。,5,：维生素与结合蛋白。,6,：糖蛋白与植物凝集素。,五：亲和层析载体的性质与选择,亲和层析载体的选择,(selection of vectors),1,：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的,大分子自由通过。,2,：颗粒均匀，具有良好的流速。,3,：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。,4,：在温和的条件下 能与配基共价偶联。,亲和层析载体的性质与选择,六：常用的亲和层析载体：,(Vectors of Affinity Chromatography),1,：纤维素,(cellulose),2,：葡聚糖凝胶,(Sephadex),3,：琼脂糖凝胶,(Sepharose),4,：聚丙烯酰胺凝胶,(Bio-gel P),5,：多孔玻璃珠,(Bio-Glass),6,：其它新型载体,(Other gels),七： 亲和层析配基的选择,(Selection of ligand),1.,纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力,.,2.,但亲和力太高也是有害的，因为在解离配,基复合物时所 需的条件就要强烈，这样可,能使生物分子变性。,3.,配基必须具有适当的化学基团，可用于和,载体相连，同时又不影响配基与生物分子,之间的亲和力。,亲和层析配基的性质与选择,配基的偶联,:,1,： 酸酐法,2,： 羟基琥珀酰亚胺法,3,：叠氮化作用,4,：还原性烷基化合物（西夫碱）的形成,第二节,:,载体、配基、目的物的连接：,(Conjunction of vector,、,ligand and target material),载体（,Vectors or Matrix),+,配基（,Ligand),+,目的物（,target material,）,见,(Fig3,Fig4, Fig5),Fig 3. AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.,Fig4,.,Spacer arm principle,A spacer is sometimes used to ensure,full accessibility of the affinity ligand.,Fig5,.,Principle of preparing AC media,第三节：亲和层析的基本操作方法：,1.,平衡（,Equilibration,）,用平衡,Buffer,冲洗柱体，至基线平稳,.,2.,样品上柱和冲洗：,（,Sample application and wash,）,样品中的目的物与层析介质选择性的吸附，杂质不被吸附。用上样,Buffer,冲洗柱体，杂质被冲洗下来。形成杂质峰（见下图）。,3.,洗脱（,Elution,）,选择适当的条件，将吸附在亲和介质上的目的物解吸下来（见下图）。,
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