微生物检测基础

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,微生物检测基础,2010年3月,9/21/2024,1,一什么是微生物？,微生物是指广泛分布于自然界中的一群肉眼看不到的微小生物，具有单细胞或简单的多细胞结构，或没有细胞结构的一群最低等的生物。,整个微生物家族的主要成员有：病毒、细菌、霉菌、酵母、蓝细菌 、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、 放线菌、微细藻类 、原生动物 。,9/21/2024,2,病毒,没有细胞结构的专性寄生的大分子生物。,如流感病毒、肝炎病毒（人体病毒），鸡瘟病毒、口蹄疫病毒（动物病毒），烟草花叶病毒、番茄丛矮病毒（植物病毒），噬菌体（细菌和放线菌病毒）等。,9/21/2024,3,细菌,单细胞原核生物,，一般在普通光学显微镜（油镜）下放大一千倍以上并染色才能清楚看见其个体。如人体肠道内的大肠杆菌、粪链球菌，用于酿醋的醋酸杆菌，使牛奶变酸的乳酸杆菌，生产味精的谷氨酸短杆菌，生产淀粉酶的枯草杆菌等。,9/21/2024,4,9/21/2024,5,酵母菌,单细胞真菌，最低等的真核生物。,一般用高倍镜（400600倍）观察其个体细胞形态。如面包酵母、酿酒酵母、红酵母等。,9/21/2024,6,霉菌,真核生物，单细胞或多细胞丝状真菌,可用低倍或高倍镜观察其形态。如酿制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生产葡萄糖的曲霉菌、生产青霉素的青霉等。,9/21/2024,7,蓝细菌（蓝绿藻）,原核微生物，单细胞或细胞聚合体。,9/21/2024,8,单细胞，介于细菌与病毒之间的一类原始而小型的原核微生物。,支原体、衣原体、立克次氏体,9/21/2024,9,微细藻类,单细胞藻类。,如红藻、绿藻、小球藻等。,9/21/2024,10,原生动物,单细胞，无真正细胞壁。,如变形虫、吸管虫、草履虫等。,9/21/2024,11,二微生物的特性,主要有四个方面,种类多,分布广,繁殖快,易变异,9/21/2024,12,1种类多,到目前为止，人们已认识的微生物已有10多万种。,9/21/2024,13,2分布广,微生物因其形体微小，重量轻，故可以随着风和水流到处传播。,岩石、土壤、海洋、湖泊、河流、大气。,动物、植物、人体表面及与外界相通的腔、道。,9/21/2024,14,3繁殖快,微生物惊人的生长繁殖速度是其他任何生物都望尘莫及的。一般细菌的世代时间为几十分钟到一百多分钟。在最适宜的条件下，人们最熟悉的大肠杆菌每1320min就可分裂出新的一代。,9/21/2024,15,4易变异,微生物容易发生变异的主要原因是个体多为单细胞或结构简单的多细胞，甚至非细胞结构，因而在受到外界物理或化学因素影响后，很容易引起细胞内的遗传物质发生突变，结果导致遗传性状，包括形态或生理表型上的变异。微生物易变异的另一个原因是细胞增殖速度快，细胞数量多，因而尽管其自发突变率很低，也会造成在短时间内产生较多的变异后代。,9/21/2024,16,三常见微生物的 形态结构,9/21/2024,17,9/21/2024,18,9/21/2024,19,9/21/2024,20,9/21/2024,21,9/21/2024,22,9/21/2024,23,9/21/2024,24,9/21/2024,25,9/21/2024,26,9/21/2024,27,四实验室微生物的培养,9/21/2024,28,实验室中微生物生长（培养）在液体或固体培养基中。细菌生长的培养基应含所有生长的基本需求：水分、碳源、氮源、无机盐及生长因子等营养物质。,细菌生长所需的营养物质,9/21/2024,29,原养型不需要在培养基中添加另外的成分，而营养缺陷型需要添加生长因子如氨基酸、维生素和含氮碱基。所用的培养基可以是所有成分及含量确切知道的限定培养基（合成培养基）和含有不确定营养物混合物的天然培养基。,9/21/2024,30,琼脂（洋菜）是用来固化液体培养基的。选择培养基或鉴定培养基是用来检测特定微生物类群的。,9/21/2024,31,生长培养基,实验室中细菌通常生长（培养，cultured）在摇瓶、瓶子或称作发酵罐的大培养容器液体培养基中或在圆的、通常为塑料、灭菌碟子培养皿的固体培养基中。,将微生物引种在这些培养基上称为接种（inoculation）。,9/21/2024,32,培养基的性质取决于微生物的天然环境和微生物生长的营养要求。,分离大量微生物用液体培养基，,固体培养基用于个别细菌的分离和保存。,9/21/2024,33,限定培养基或合成培养基,含有通常为特定微生物生长基本要求的确定成分。通常是简单的（最低的）、含有最低生长要求的培养基。,9/21/2024,34,天然培养基,天然培养基含有不确定的成分如蛋白胨（大豆粉酶消化液）和提供足够营养成分的酵母提取物（氨基酸、维生素、糖和碱基），适合广泛范围微生物的生长。,天然培养基如营养肉汤（NB）和胰胨、豆胨肉汤（TSB）是实验室中常规用的细菌培养基，特别对生长要求还未确定的细菌生长使用。,9/21/2024,35,常用血液作培养基的附加成分分离人类病原菌，由于它提供许多难养的人类病原菌生长的基本营养，如链球菌。特殊的选择培养基和鉴别培养基经常用于分离特定的微生物类群，尤其在医院的实验室中。,9/21/2024,36,选择培养基与鉴别培养基,设计这些培养基是为,选择特定类群的微生物或鉴别两种菌种时用。,选择培养基含有抑制非目的细菌生长的成分，鉴别培养基是添加某种营养物或和化学物质，促进所要的微生物生长，使在鉴别培养基平板上两种不同的微生物的菌落可以区分开来。,9/21/2024,37,生长的环境条件,温度,氧浓度,PH,水活度,9/21/2024,38,温度,嗜冷微生物适合于10生活的细菌，最适生长温度在20左右。嗜温微生物生长温度在1545之间，最适生长温度在37左右的细菌。嗜热微生物生长温度在3075之间，最适生长温度在55，在100以上温度生长，称为嗜高热微生物。,9/21/2024,39,氧浓度,根据细菌对氧要求的不同分为好氧菌，厌氧菌，包括专性厌氧菌、兼性厌氧菌、严格厌氧菌和耐氧菌,微好氧在正常大气氧浓度20情况下就受到损伤，只能在更低的氧浓度下才能存活。,9/21/2024,40,pH值,嗜碱菌（alkaliphiles）,：生长在高pH（8.511.5）的微生物。,嗜酸菌（acidophiles）,：生长在低pH（05.5）中的微生物。,9/21/2024,41,水活度,像所有生物一样，微生物对周围环境的渗透压是敏感的。低渗透压时，水将聚集于细胞内，高渗透压时水逸出。,9/21/2024,42,五微生物的生长,9/21/2024,43,1细菌以二等分裂方式（124）分裂，细菌的生长为指数生长。群体细胞数目加倍所需的时间为倍增时间（,t,d,）。,9/21/2024,44,细菌典型生长曲线,log,10,稳定期（平衡期）,活,细 对数期 衰亡期（死亡期）,胞 延迟期 （指数期）,数（延滞期）,培养时间,9/21/2024,45,2真菌的生长,真菌是丝状的、无光合作用的、营异养性营养的真核微生物。,9/21/2024,46,真菌生长的各个时期,稳定期,细 减速期,胞 直线期 自溶期,数,目,延迟期,指数期,培养时间,9/21/2024,47,3微生物生长的测定方法,微生物的生长可用原生质的增加、细胞数目的增加或以代谢活动情况作指标。根据细胞 的干重或某一化学成分如总氮含量数量很少，以至误差很大。最常采用的微生物生长的方法是统计群休数目。,9/21/2024,48,(1)活菌计数法,有时一个菌落并非绝对地都是由一个单细胞所长成的，往往两个或两个以上相连结的细胞只长成一个单菌落；有些细胞比其它细胞较早地分裂，分裂的速度也快，于是它就首先出现可见的菌落，而其它的细胞较迟才出现菌落，所以，必须培养足够长的时间，才能使所有的菌落增至足以肉眼看见的大小，一般至少需要24-48小时，有些生长较缓慢的微生物甚至需要几天至一星期；此外，要控制培养皿内出现的菌落数不宜过多。,9/21/2024,49,（2）计算器法,将待检菌液充分混匀，注入改良纽氏血球计数板，计数一定量的菌液中所含菌数，计算出每毫升所含菌数。,9/21/2024,50,（3）比浊法,据细菌悬浮液的透光量间接测定细菌的数量。,细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光的穿透量成反比，与光密度成正比。对于丝状真菌的生长率，可以根据菌丝的生长长度或菌丝增加的重量。,9/21/2024,51,六微生物生长的控制,使工作者免受他们所研究的微生物伤害和所研究的微生物培养物不受环境中其他微生物污染的方法称作无菌（灭菌）技术。,9/21/2024,52,1灭菌方法,9/21/2024,53,9/21/2024,54,9/21/2024,55,9/21/2024,56,自动高压蒸汽灭菌锅,9/21/2024,57,2消毒剂与防腐剂,消毒剂是用于非生命体杀菌的化学物质,防腐剂是能杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质，这类物质对活组织是无毒性。,9/21/2024,58,9/21/2024,59,9/21/2024,60,防腐剂,用于健康有关的方面,作用模型,氯气,净化生活用水,氧化剂,氯化物,牛奶厂、食品工业设备、生活用水,氧化剂,阳离子去污剂,（四胺基化合物）,医疗器械、食品、制酪设备,与磷脂作用,环氧乙烷（气体）,实验室中的热敏感材料如塑料,烷基化试剂,臭氧,饮用水,强氧化剂,9/21/2024,61,七微生物的观察,9/21/2024,62,1细菌的染色,原理：,细菌是无色透明的。在光学显微镜下，菌体与其背景相差很小，不易看清细菌的形态和结构，故通常要对细菌用染料染色，以增加菌体与背景的反差，便于在光学显微镜下观察。,9/21/2024,63,细菌染色所用的染料，按其所带电荷状态分，,碱性染料和酸性染料。,碱性染料：结晶紫、龙胆紫、碱性品红（复红）、蕃红、美蓝、甲基紫、中性红、孔雀绿等。,酸性染料：酸性品红、刚果红、曙红等。在通常的培养条件下细菌带负电，碱性染料带正电荷，易与菌体的酸性物质（带负电荷的细胞成分有核酸和酸性多糖）牢固地结合。所以，多采用碱性染料染色。,只有在分枝杆菌属（Myoobaoterium）或诺卡氏菌属(Macardia)中的一些菌才能用酸性染料（石碳酸品红）染色（抗酸性染色）。,9/21/2024,64,方法,简单染色和复合染色法。,简单（单）染色法只用一种染料染菌体，目的仅为增加反差，便于观察。,复合（杂）染色法是用两种染料染色，以区别不同细菌的革兰氏染色反应或抗酸性染色反应；或将菌体和某一结构染成不同颜色，便于观察。,9/21/2024,65,革兰氏染色法,革兰氏染色是最普通的细菌染色之一，根据它们细胞壁的结构，把细菌分成两类。,革兰氏阳性细菌细胞围绕原生质膜的外膜是由厚的肽聚糖层组成。,革兰氏阴性细菌只有一个薄的外部的肽聚糖层，但在其外面还有第二层胞壁外膜。革兰氏阳性细菌用乙醇冲洗时保留了结晶紫和碘的复合物，因此光学显微镜下呈现紫色。革兰氏阴性细菌由于它们失去了结晶紫和碘的复合物，并且吸收了较浅的石炭酸复红，复染成粉红色。,9/21/2024,66,革兰氏染色法,9/21/2024,67,（1）用接种环取少量细菌在干净的载玻片上涂布、固定。,（2）用草酸铵结晶紫染色。,（3）用弱酸性媒剂碘碘化钾溶液媒染。,（4）用中性脱色剂，如乙醇或丙酮脱色，能被脱色的叫革兰氏阴性菌，其菌体无色；不能被脱色的叫革兰氏阳性菌，其菌体呈紫色。,（5）以上四步已能区分两大类细菌，为了使革兰氏阴性菌易被观察，还需用与草酸铵结晶紫颜色鲜明对比的品红或蕃红复染。经脱色的革兰氏阴性菌被染上红色，没有脱色的革兰氏阳性菌染不上红色，仍呈紫色。,革兰氏染色法步骤,9/21/2024,68,八微生物的分离,9/21/2024,69,细菌的纯培养,实验室中通常需要细菌的纯培养，即所有的细胞都来自同一个最初的细菌。,采用,划线平板法和倾注平板法,接种细菌到琼脂平板以获得彼此分离的单个细菌细胞。经合适温度培养后，每一个细菌形成一个肉眼可见的菌落，含有相当于10,9,个细菌细胞。,9/21/2024,70,划线,划线,烧接种环,烧接种环 灭菌通过本生煤气灯,培养后的,单个,菌落,烧接种环,划线,划线分离细菌培养物为单菌落的示意图,9/21/2024,71,转移1ml 转移1ml 转移1ml,加1ml,菌液计数,10,-1,10,-2,10,-3,10,-4,0.1ml涂布平板,计数太多 62个菌落 计数太少,菌落数目稀释倍数细胞数（菌落形成单位，CFU）ml原菌液,6210,3,10（吸取0.1ml到平板）6.210,5,CFU/ml,9/21/2024,72,谢谢,9/21/2024,73,