层析工艺设计以及优化1

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,层析工艺设计和优化,李 岩,email:,liyan,中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,第一部分,基础理论,分离纯化的一般流程,细胞破碎,澄清,分离,破碎细胞概述,珠磨,压榨,固体剪切,高压匀浆,超声,液体剪切,机械法,冻溶法,酶溶,化学,去垢剂,溶胞作用,非机械法,细胞破碎方法,压撞 剪切 渗透 冻胀 破壁破膜,超声破碎,(Ultrasonication),作用机理：,声频高于,15-20KHz,的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，,破碎机理一般认为与空化现象,(Cavitation),引起的冲击波和剪切力有关。,空化现象是在强声波作用下，气泡形成、长大和破碎的现象。,超声破碎的效率与,声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型,等因素有关。,反复冻融法,细胞含有大量水份，快速冷冻时，胞内水结晶形成大量晶核，体积增大将细胞胀破达到破碎细胞的目的；此外，冷冻过程促使细胞膜疏水键断裂增加了细胞的亲水性。,一般将,40-70%,的细胞悬浮液放入低温冰箱使之快速冷冻，冻结后，取出在室温下融化，然后再冷冻，反复进行，通常需三次以上，酶的释放率才可能达到满意。,冻融法十分简便，无需特殊设备，在实验室中使用很方便，但耗时，耗能，大规模应用困难。,高压匀浆法,高压匀浆器：由高压泵和匀浆器组成,易于实现工业放大,珠磨破碎法,利用珠磨机内大量的研磨剂,(,玻璃珠、钢珠或陶瓷珠,),在搅拌桨的作用下通过碰撞、剪切等作用撕破或磨碎细胞以达到胞内产物释放的目的。珠磨机物料的出口处设有夹缝或筛孔板用以截留珠体，从而实现连续操作。,指标,高压匀浆法,高速珠磨法,操作参数,少，易于确定,多，凭经验估计,操作次数,2,4,次,1,次,冷却,用换热器级间冷却,采用夹套冷却，减少产品失活可能,应用范围,丝状真菌和小革兰氏阳性菌,及含包涵体细胞除外,几乎所有微生物,制备放大,易,较难,高压匀浆法同高速珠磨法的比较,不论高压匀浆法和高速珠磨法，都不仅以破碎率为基准，而需考虑产物的收率和兼顾上下游过程,澄清技术概述,离心：适用于实验室,过滤：板框过滤适用于生产,微滤：采用不同的组件适用于实验室和生产规模,分离方法概述,沉淀法：经典的方法（血液制品生产中仍在沿用）,超速离心,：分离病毒的,经典方法,超滤：主要用于浓缩和缓冲液置换,层析：目前,GMP,发展的趋势,沉淀法,盐沉淀,有机,溶剂沉淀,等电点沉淀,酸沉淀,非离子多聚,物沉淀,聚电解质沉淀,水化层的破坏,静电排斥力的降低,疏水性的增加,大分子的介导,脱水过程示意图,冷乙醇沉淀法制备血浆蛋白,各步所沉淀下来的蛋白,超离心技术,发展历史,Svedberg,，,winner of the 1926 Nobel Prize in chemistry for his work on colloids and his invention of the ultracentrifuge,优良的学术传承,Tiselius1948,年诺贝尔化学奖,Bjorn Ingelman,发现了葡聚糖,Porath and Flodin,于,1959,年在,Nature,上发表了有关凝胶过滤层析的第一篇论文,书籍推荐,金绿松，林元喜主编,离心分离,，化学工业出版社出版，,2008,年,单元操作超速离心,因子,Fr,：离心力,/,重力的比值,离心分离,Fr=1.11910,-5,n,2,r,n:,转速，转,/,分钟；,r:,转鼓半径，,cm,衡量离心设备的离心程度的重要技术参数,按分离因子,Fr,分类,1),、常速离心机,Fr 1.9,1.3,Cs,2,SO,4,1.43,1.45,1.64,1.3,Metrizamide,1.12,1.14,1.17,1.27,Nycodenz,1.12,1.16,1.18,1.27,沉淀系数的物理意义,沉淀系数指单位离心力场（,w,2,x,）作用下的沉降速度（,dx,/,dt,），沉降系数的单位为秒,蛋白质、脂蛋白、核糖体和病毒等的沉降系数介于,1*10,-13,200*10,-13,秒。为方便起见把,10,-13,秒作为,1,个单位，成为,Svedberg,单位,区带离心和区带转子,区带离心是指把样品中不同的颗粒分离成不连续的区带,区带转子是指一类结构与操作方式特殊的转子,密度梯度离心,速度,-,区,带密度梯度离心法,将样品置于一密度梯度,介质顶层,，该梯度最大密度低于拟分离混合物的最小密度，离心时各,物质按,其大小、形状和密度的不同而沉降速率各异，分别沉降在不同区带而达到分离的方法。,等,密度梯度离心法,等密度离心分离样品主要是根据被分离样品,的,密度,。,在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度， 这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的唯一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于,1%,就可用此法分离。,转子类型,角转子,甩平,转子,垂直,转子,规模化生产的超速离心机,Optima L-100XP 100,000 rpm; 802,400 x g,Optima L-100K 100,000 rpm; 802,400 x g,Optima L-90K 90,000 rpm; 694,000 x g,Optima L-80XP 80,000 rpm; 602,000 x g,密度梯度离心病毒颗粒的制备,密度梯度的加样量,样品浓度过大，会产生液流，并且有可能产生沉淀。过高的浓度也会使分离区带变宽而丧失分辨率。,当颗粒沉降系数或者浮力密度差较小时，上样体积不超过梯度体积的,5%,。,梯度斜度越大，承载的样品量也越大。比如,10-50%,梯度的最大上样量要比,5-20%,梯度的最大上样量大。,对于区带转子，样品浓度低于起始梯度浓度的,40%,。,蔗糖密度梯度离心,离心时间的影响（改变颗粒移动的时间）,密度梯度的影响（改变介质的密度，从而改变颗粒的移动速度）,离心温度（改变离心介质的粘度，从而改变颗粒移动速度）,仅通过蔗糖密度梯度离心很难得到,EV71,病毒颗粒的纯品，在此体系中条件优化不能实现质的提高,CsCl,等密度梯度离心的条件摸索,密度梯度和,取样编号,密度,g/mL,抗原,U/mL,蛋白浓度,mg/mL,比活,U/mg,1,(25-30-35-40%)-3,1.058,1.2910,3,0.5576,2.3,2,(25-30-35-40%)-5,1.104,-,6.470,-,3,(25-30-35-40%)-6,1.123,-,10.54,-,4,(25-30-35-40%)-7,1.166,-,6.573,-,5,(25-30-35-40%)-8,1.197,-,3.502,-,6,(25-30-35-40%)-10,1.224,1.4310,5,8.510,16.8,7,(25-30-35-40%)-11,1.286,1.4710,4,0.8211,17.9,8,(25-30-35-40%)-12,1.362,7.8610,3,0.2327,33.8,9,(20-40-60%)-3,1.032,1.0310,3,1.115,0.9,10,(20-40-60%)-4,1.060,7.8910,3,3.375,2.3,11,(20-40-60%)-5,1.081,-,12.82,-,12,(20-40-60%)-6,1.149,-,15.69,-,13,(20-40-60%)-7,1.268,2.1510,5,16.10,13.4,14,(20-40-60%)-8,1.383,3.7210,4,0.9149,40.6,15,(20-40-60%)-9,1.494,7.3710,3,0.05449,135,1 2 M 3 4 5 6 7 8,9 10 11 M 12 13 14 15,等密度离心介质的筛选,样品,密度,g/mL,抗原,U/mL,蛋白浓度,mg/mL,比活,U/mg,1,NaI,第,5,管,1.356,1040,2752,0.4,2,KI,第,10,管,1.322,-,3474,-,3,KI,第,11,管,1.379,-,511.9,-,4,KI,第,12,管,1.418,-,211.7,-,5,NaBr,第,8,管,1.292,53875,3450,15.6,6,NaBr,第,9,管,1.333,3453,358.2,9.6,7,NaBr,第,10,管,1.379,1463,28.83,50.7,2 3 4 M 5 6 7,注：,KBr,在,4C,下结晶析出，所以没有考察,采用,NaBr,代替昂贵的重金属盐,CsCl,，为,EV71,的纯化提供了一个新的途径！,单元操作超滤,膜分离特点,膜分离技术是用半透膜作为分离层，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。,它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和节省能源等优点。膜分离的驱动力是膜两侧溶液状态的差别。膜两侧的压力（微滤、超滤、反渗透）、浓度（透析、渗透蒸发）、电位（电渗析）等的差别均可作为分离的驱动力。,微滤和超滤,微滤的分离原理为筛分原理，膜的孔径为,0.0510m,，采用的压力为,0.050.5MPa,。微滤技术主要用于消毒、澄清、细胞收集等过程。,超滤的分离主要也是筛分原理，但有些情况下受到粒子荷电性的影响。超滤膜的孔径为,0.0010.05m,，它可以分离分子量从,3k,到,1000k Da,的可溶性大分子物质，采用的压力为,0.11MPa,。超滤技术主要用于浓缩，也可以用于分离过程，但是分离效率不高。当目标蛋白质与杂质的分子量差别达到一个数量级时，才可能用超滤技术实现有效的分离。,影响分离的因素,膜的类：包括膜的材料，膜孔的大小，膜的内部结构以及膜组件的类型等。,操作条件：包括膜两侧压差、切向流速和温度等。,溶液环境：包括蛋白质浓度、物料的,pH,值、盐的类型及其浓度等。,浓度极化,A:,过滤，被膜阻挡物质在膜表面积累，形成浓度梯度,B:,切向流动使膜表面积累的物质在剪切作用下返回液流,当,A,速度,B,速度时：,在膜面附近形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层，这一现象称为浓度极化,可逆过程，在过滤中产生，停止过滤，极化逐渐消失,A,B,曲线代表被膜阻挡物质的浓度变化，在距离膜表面处形成边界层，浓度呈指数形式增加,膜的污染,物料中微粒、,胶体粒子或,溶质大分子,膜,物理化学或,机械作用,膜孔径变小,或堵塞,膜透过流量,分离特性,不可逆改变,与初始纯水透水率相比，可降,10%,到,80%,层析的分类,吸附解吸类,蛋白质分子与介质有相互作用,离子交换层析、反相层析、疏水相互作用层析、亲和层析,非吸附解吸类,蛋白质分子与介质之间没有相互作用,体积排阻层析：根据分子大小进行分类,吸附解吸类层析,配基的类型决定色谱的模式,Affinity,(Biorecognition),生物识别,Reversed phase,(Hydrophobicity),疏水相互作用,HIC,(Hydrophobicity),疏水相互作用,Ion exchange,(Charge),电荷,层析的影响因素,溶液,pH,溶液温度,溶液盐浓度,溶质浓度,介质粒径大小,介质粒径分布,孔径大小,孔径分布,常用的基本概念,固定相,流动相,分配系数（,C,s,/C,m,）,分辨率（,R,s,=1,每种组分纯度为,98%,；,Rs=1.5,每种组分纯度为,99.8%,）,容量因子（,D,）：固定相与流动相中溶质量的分布比,分离因子（,）： 两种组分容量因子之比,操作容量：某种组分与固定相反应达到平衡时，介质的饱和容量；通常上样量应少于,20%,的操作容量,速率方程各项的意义,为塔板高度,为涡流扩散相,为纵向扩散相,为固定相传质阻力相,为滞留流动相传质阻力相,为流动相传质阻力相,液相色谱系统组成,动力系统,进样系统,分离系统,检测系统,记录系统,凝胶过滤层析,Gel filtration,(Porath, Flodin, 1959),Size exclusion chromatography,(Pedersen, 1962),Molecular sieve chromatography,(Hjertn, Mosbach, 1962),Gel permeation chromatography,(Moore, 1964),凝胶过滤层析的用途,分析柱用途,制备柱用途,确定分子量大小,确定样品纯度,研究蛋白质的结构,脱盐,缓冲液置换,在蛋白质分离中常作为精制步骤去除,DNA,，以及小分子等杂质,在病毒分离中作为第一步去除大部分分子量较小的杂质,GF,基本操作程序,平衡,上样,洗脱,一般来说上样体积应低于,5%,的柱体积，对于分析柱，则不超过,1%,的柱体积,凝胶过滤层析中的基本概念,分离度和柱效,介质的特点,琼脂糖,A good gel for gel filtration contains about,95% water,影响凝胶过滤层析的因素,介质种类和颗粒大小,样品体积和浓度,流速,孔径大小,颗粒大小的影响,Superdex Peptide,13-15 m,Superdex 30 prep grade,24-44 m,样品体积对于分辨率的影响,蛋白,Tf,和,IgG,的进样体积对分离精度的影响,样品浓度的影响,使用注意事项,凝胶过滤层析最好使用进口层析柱,装柱技术非常关键，有条件尽量使用预装柱,对于某些分析柱，调节盐浓度可能会产生提高分辨率的效果,蛋白质的吸附解吸类层析,蛋白质与小分子吸附解吸过程的最大不同：,蛋白质不同的构象之间的能量差别较大，小分子则很小或没有,蛋白质吸到介质以后，除非改变流动相条件，否则不会解吸下来，会越吸牢固,蛋白质更倾向于吸附机理，小分子更倾向于分配机理,平衡,进料,淋洗,洗脱,再生,平衡,操作程序,离子交换层析,pH,值,缓冲溶液类型,洗脱盐的类型,介质粒径,介质孔径,配基类型,配基密度,影响因素,根据蛋白质与介质之间静电吸附的强弱进行分离,离子交换层析的用途,步骤,纯度,further removal of most proteins, further removal of most nucleic acids, further removal of endotoxins, further removal of viruses,initial purification,stabilization,clarification,concentration,achieve final purity and safety, additional safety measure,3.,精制,1.,捕获,2.,中间纯化,可用于分离纯化的各个阶段,第一步最常用,有时也可以用于最后一步,强和弱的区别,Weak anion,exchanger,Weak cation,exchanger,Strong anion,exchanger,Strong cation,exchanger,强弱在于它们的电荷基团完全解离的,pH,范围，强酸型在较大,pH,范围内完全解离，弱酸型完全解离的,pH,范围较小,强酸型离子交换剂对,H,+,的结合能力比,Na,+,小，弱酸型则反之,强碱型离子交换剂对,OH,-,的结合能力比,Cl,-,小，弱酸型则反之,常用的类型,葡聚糖凝胶型,DEAE-Sephadex A-25,，,QAE-Sephadex A-25,，,CM-Sephadex C-25,，,SP-Sephadex C-25,纤维素系列离子交换剂,DEAE-Sephacel Cellex,系列,琼脂糖系列离子交换剂,GE,公司的,Sepharose,系列,Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow,Bio-Gel A,系列交联琼脂糖离子交换剂,Source,系列离子交换剂,特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低,阳离子交换树脂,S,系列,阴离子交换树脂,Q,系列,MonoBeads,系列离子交换剂（,Pharmacia,）,特点：介质为亲水性聚醚，具有和,Source,系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。,同样分为,Q,系列和,S,系列,常用的电荷基团,阴离子交换剂,-Diethylaminoethyl (DEAE)-CH,2,CH,2,N,+,(CH,2,CH,3,),2,-Quaternary aminoethyl (QAE)-CH,2,CH,2,N,+,(C,2,H,5,),2,CH,2,CHOHCH,3,-Quaternary ammonium (Q)-CH,2,N,+,(CH,3,),3,阳离子交换剂,-Carboxymethyl (CM)-CH,2,COO,-Sulphopropyl (SP)-CH,2,CH,2,CH,2,SO,3,-Methylsulphonate (S)-CH,2,SO,3,pH,值对蛋白质电荷的影响,Overall charge on protein,+,-,NH,3,R,COOH,+,NH,3,R,COO,+,-,R,NH,2,COO,-,acid,isoelectric point,alkaline,excess positive charge balanced positive and negative charge excess negative charge,pH,pH,3,10,利用,pH,值提高选择性,Charge on protein,-,+,pH,3,10,Anion exchanger,Cation exchanger,不同缓冲体系的缓冲能力,To ensure a proper pH value, the sample should be dissolved in buffer A, (critical with large volume samples).,Buffering ion concentrations of 2050 mM are usually sufficient.,AU,volume,pH value,gradient,volume,AU,pH value,gradient,阴离子交换可选缓冲体系,pH,4,5,6,7,8,9,10,11,12,N-Methylpiperazine,Piperazine,L-Histidine,Bis-Tris,Bis-Tris-propane,Triethanolamine,Tris,N-methyldiethane,Ethanolamine,(hi) Piperazine,(hi)1,3-diamino,Piperidine,BufferPrep AIEX,阳离子交换可用缓冲体系,使用,pH,值应注意的地方,蛋白质带电不均一，,pH,在等电点之下时，蛋白质整体带正电，但是也存在带有负电的基团，所以也可能和阴离子交换层析发生作用；阳离子层析也是如此,pH,值筛选过程,1.,先考察不同蛋白质稳定的,pH,范围,确定可使用的,pH,值,2.,静态实验考察蛋白发生的吸附的,pH,值,进一步缩小,pH,值范围,1),Put 1 ml ion exchanger into several tubes,2) Add buffers with different pHs,3) Add sample, mix,4) Analyse the supernatants for the protein of interest,Here the target binds completely at pH 7.5 and above.,Conclusion:,Anion exchanger, initial pH 7.5.,pH,值筛选过程,3.,通过层析选择最佳的,pH,值,根据目标是分析还是分离，指标是纯度还是收率进行选择,mAU,Elution volume (ml),M NaCl,1,0.5,0,pH 5,pH 6,pH 7,pH 8,pH 9,pH scouting for the,separation of pancreatin,Conditions:,System:KTAexplorer 100, BufferPrep,Column:RESOURCE Q, 6 ml,Sample:2 mg crude pancreatin,不同的洗脱方式,阶跃梯度,(Step gradient),线性梯度,(Linear gradient),综合,pH,梯度,盐梯度,联用,pH,和盐,简单，易实现,标准方法，分离精度高,省时、效率高,很少用,标准方法,灵敏，但难控,蛋白质层析中的线性洗脱和阶梯洗脱,进行蛋白质分离时，阶梯洗脱往往有更好的效果,盐类型的影响,不同盐浓度具有相同洗脱力,:,Sulphate (SO,4,2-,) 150 mM,Chloride (Cl,-,)350 mM,Acetate (CH,3,COO,-,)700 mM,阴离子对于阳离子层析，以及阳离子对阴离子层析也会有影响,hofmeister,效应,离子交换层析小结,原理,如何筛选最佳,pH,值,洗脱盐的影响,其它操作细节（如平衡柱体积，温度，蛋白质与介质表面的接触时间等等）,疏水相互作用层析,pH,值,盐的类型,盐的浓度,介质粒径,介质孔径,配基类型,配基密度,影响因素,根据蛋白质与介质之间疏水相互作用的强弱进行分离,疏水层析的用途,步骤,纯度,further removal of most proteins, further removal of most nucleic acids, further removal of endotoxins, further removal of viruses,initial purification,stabilization,clarification,concentration,achieve final purity and safety, additional safety measure,3.,精制,1.,捕获,2.,中间纯化,用于分离纯化的头两个阶段,最后一步很少用,疏水配基类型的影响,丁基,辛基,低密度苯基,高密度苯基,相同配基类型，不同配基密度可使蛋白质的层析行为有很大的差别,盐浓度的影响,盐浓度过低蛋白质不能够与介质发生吸附,盐浓度过高蛋白质吸附太强，在柱上变性,盐类型的影响,Cl,-,之前的称为,kosmotropes,（,water structure maker,）,Cl,-,之前的称为,chaotropes,（,water structure breaker,）,Franz Hofmeister,Franz Hofmeister (18501922),不同离子对于蛋白质沉淀的影响（,1888,）,对于早期的蛋白质纯化是基础性和指导性的工作,最早认识到蛋白质是由氨基酸组成的科学家（,1902,）,是溶液化学的基础和核心问题,Hermann Emil Fischer (1952-1919),证明蛋白质是由氨基酸组成的科学家（,1902,）,疏水层析最佳条件的选择,1,考察不同盐对于蛋白质在溶液中稳定性的影响,疏水层析最佳条件的选择,2,静态吸附筛选能够实现有效吸附的盐类,盐,上清中的活性,解吸后的活性,(NH,4,),2,SO,4,8.03%,36.3%,Na,2,SO,4,6.72%,43.1%,NaCl,16.0%,28.2%,KCl,15.4%,13.4%,NH,4,Cl,17.2%,18.5%,KNO,3,16.8%,5.76%,KBr,17.3%,7.02%,A/B,7.55%,39.7%,只有三种盐的吸附效果比较好，其它的盐虽然在溶液中对,HBsAg,的活性没有损失，但是对,HBsAg,没有明显的吸附效果,疏水层析最佳条件的选择,A/B,抗原收率,纯化倍数,1/3,31.0%,2.58,1/1,52.0%,3.82,2.6/1,63.0%,6.45,7/1,74.6%,5.10,介质,/,破碎液,抗原收率,纯化倍数,1,：,4,40.6%,12.2,1,：,6,87.2%,25.8,1,：,8,61.6%,16.2,1,：,10,38.5%,7.78,盐类型,调电导收率,层析收率,总收率,(NH,4,),2,SO,4,68.6%,60.1%,41.2%,Na,2,SO,4,75.6%,37.0%,27.9%,A/B,77.4%,76.4%,59.1%,盐比例浓度的影响,载量的影响,盐类型的影响,盐浓度的影响,电导率,抗原收率,纯化倍数,65.1mS/cm,70.1%,7.23,74.3mS/cm,89.8%,10,79.9mS/cm,103%,8.65,3,动态层析的进一步优化,反相层析简介,反相层析和疏水层析的差别,反相层析是目前分辨率最高分析类色谱,亲和层析,亲和层析,是通过生物特异性差异分离样品的液相层析技术,优点：,易于分离其它方法难以分离的样品,单步纯度往往可达到,95%,以上,易于从大量杂质或类似物杂质中分离出特定目的蛋白,速度快,应用广泛单抗、多抗、融合蛋白、酶、,DNA,结合蛋白,亲和层析的关键在于配基的选择,典型的洗脱图形,平衡,进料,淋洗,洗脱,再平衡,配基的选择,Mono-specific ligands,Specific for a single substance:,Antigen,antibody,Hormone,receptor,Group-specific ligands,Specific for a group of structurally or functionally similar substances:,Lectins glycoproteins,Protein G IgG antibodies,Dye-stuffs enzymes,纯化不同物质需要不同配基,一般不具有通用性,多数情况下特殊生物活性分子无现成商品介质可供使用,选择合适的配基是关键,常用配基类型,LigandSpecificity,Protein AFc region of IgG,Protein G Fc region of IgG,Concanavalin AGlucopyranosyl & Mannopyranosyl groups,Peanut LectinTerminal galactose group,Cibacron BlueBroad range of enzymes, serum albumin,Procion RedNADP+ dependent enzymes,LysinePlasminogen, ribosomal RNA,基质的选择,在多孔性、稳定性、机械强度等方面与,IEC,等介质相同,必须易于活化但又必须具有一定惰性以防非特异性吸附,基质物化性质不应与配基分子键合后发生显著改变,颗粒均一度要求高，以保证配体分子均匀分布,影响亲和层析的因素,基质的选择（乙肝病毒表面抗原亲和层析）,配基的选择,特异性、可逆性、稳定性、配基分子大小,化学间臂的选择,消除空间位阻、长度、亲水性,介质与配基的键合,基质表面活化,-,化学反应，如,CNBr,活化琼脂糖羟基,介质活化基团与配基上的氨基、羧基、羟基、巯基或醛基等发生共价结合反应键合过程,应用实例单克隆抗体,Sample: 600 ml mouse monoclonal IgG,2a,Gel:,rProtein A Sepharose Fast Flow,Elution:20 mM Sodium Citrate, pH 4.0,Result:,83 mg Mab, recovery 95%,Starting material,Eluate,94,KD,67KD,43KD,SDS-PAGE reduced,应用实例组氨酸标记融合蛋白,Sample:5 ml cytoplasmic extract containing (His),6,-tagged GST,Column:In HisTrap kit,Elution:Phosphate buffer, 500 mM imidazole, pH 7.4,Result:4 ml eluted GST-(His),6,A,280,:1.65. Total amount: 4.5 mg,Starting material,Flow-through,Eluted GST-(His),6,GST standard,SDS-PAGE,94.0,67.0,43.0,30.0,20.1,14.4,第二部分,应用部分,分离纯化在生物药品中的作用,血液制品,分离纯化技术是核心技术,疫苗,给正常人群使用，对其要求非常严格。在某些类产品中，分离纯化是技术难题,生物制剂,分离纯化是最关键技术之一,细胞破碎液,离心机,疏水层析,凝胶过滤层析,离子交换层析,脱盐,浓缩,纯化流程示意图,关于纯化技术认识误区,只要在蛋白上加上一个标签，就可以用金属螯合进行纯化，是否还需要其它技术？,重组技术的局限性：分子量越大的蛋白质，重组蛋白与天然蛋白在结构上的差别越大，如重组的,VIII,因子以及重组疫苗,亲和层析技术的局限性：主要应用于实验室研究，在复杂体系中仍然会吸附其它的杂蛋白，存在着配基脱落,关于纯度的认识误区,不仅要看纯度，还要看均一性以及结构是否正确。如大肠杆菌表达产物的,N,端非均一性，包涵体的复性等等。,纯度受分析方法精确度的限制,。,如说纯度达到,99.9%,，必须说明所采用的分析方法以供判断是否可靠,分离纯化过程中纯度可用于评价分离效果但不一定代表产品质量。,蛋白质纯化的核心问题,蛋白质在纯化过程中的结构变化,HBsAg,的,DEAE,层析谱图,HBsAg,的二级结构变化,HBsAg,的四级结构变化,HBsAg,在界面上变化的在线监测,HBsAg,纯品在离子交换层析上会分裂为两个峰，这说明其结构在层析中可能会发生变化,层析技术的分类,吸附解吸类,非吸附解吸类,离子交换层析；疏水相互作用层析；反相层析；亲和层析,凝胶过滤层析（体积排阻效应）,高速逆流层析（两相分配）,优点：分辨率高,缺点：存在吸附,优点：没有吸附,缺点：分辨率高,蛋白质纯化与小分子纯化的差别,蛋白质分子不同构象之间存在能量差别，吸附到表面后会朝自由能减少的方向变化。若不改变洗脱条件，被吸附的蛋白质永远不会被洗脱下来。,小分子不同构象之间的能量差别很小。不改变洗脱条件，小分子也能被洗脱下来，只是需要的时间比较长,进行蛋白质分离时，阶梯洗脱往往有更好的效果,温度的影响,温度对体系平衡状态有影响,温度越高对蛋白结构变化速率有影响,温度对,HBsAg,在层析介质表面解聚速率的影响,不同温度对于病毒颗粒纯化效果的影响,停留时间的影响,停留时间，,A,：,0min,；,B,：,30min,；,C,：,60min,；,D,：,90min,蛋白质与介质表面接触的时间越长，发生结构变化的蛋白所占比例越多，或者发生的结构变化越明显,盐的类型和浓度的影响,Cl,-,之前的称为,kosmotropes,（,water structure maker,）,Cl,-,之前的称为,chaotropes,（,water structure breaker,）,盐的类型对于层析的影响非常复杂,Hofmeister,序列中靠前例子容易使,HBsAg,在溶液中聚集，但是能够使其吸附于疏水层析介质上；序列中靠后的盐在溶液中对,HBsAg,稳定，但是不能够使其发生有效吸附。混合使用两种盐可以使,HBsAg,吸附再介质表面，又不会发生太大的结构变化,盐的类型对于,HBsAg,的影响,载量的影响,进料量对于,HBsAg,收率的影响,进料量对于,HBsAg,结构的影响,随着,单位面积上,蛋白质的,吸附量，,蛋白质,分子之间拥挤作用可以减少其结构变化。,层析过程的放大,放大过程受到反应和传质两个方面的影响,吸附诱导的反应和蛋白与介质的接触时间有关，由体积流速决定,传质包括宏观流动和分子扩散两个方面，由线性流速决定,保持柱子高度不变，扩大直径，按照线性流速放大可以保证反应和传质都不发生变化,分离纯化三步曲,步骤,纯度,further removal of most proteins, further removal of most nucleic acids, further removal of endotoxins, further removal of viruses,initial purification,stabilization,clarification,concentration,achieve final purity and safety, additional safety measure,3.,精制,1.,捕获,2.,中间纯化,综合考虑各种因素,最小化操作体积,最少化操作步骤,组合不同机理分离技术,分辨率,处理量,回收率,速度,重组乙肝病毒表面抗原纯化工艺,Intermediate,Purification,CCS,Butul-S Sephros 4FF,DEAE Sepharose FF,Sepharose 4FF,Capture,Polishing,最终纯品的鉴定,多种手段综合表征表征,二级结构,其它性质,三级结构,（侧链微环境）,四级结构,远紫外圆二色谱,红外光谱,拉曼光谱,凝胶过滤高效液相,多角度激光散射,动态光散射,分析离心,荧光光谱,院子外圆二色谱,二硫键、糖基化、,N,末端等等,颗粒大小以及分布,表面电势,蛋白在表面上结构的原位表征,H-D,交换,双偏振极化干涉,原子力显微镜,几个常被忽略的注意事项,一定要先查阅文献，再开展实验。不要马上对介质和实验条件展开筛选，经过数十年的积累，很少有蛋白质的纯化工艺没有任何人做过,一定,要保证物料的新鲜，尤其细胞破碎液必须马上进行试验（破碎后一周后物料的层析行为与刚破碎时的差异非常大），很多实验的重复性不好不是因为介质或者缓冲液不稳定，只是物料的时间放得时间长了。,缓冲溶液,pH,值的控制,实际工艺举例,木糖还原酶的纯化,组分,IV,的综合利用,汉逊酵母表达乙肝病毒表面抗原的纯化,EV71,病毒颗粒的纯化,木糖还原酶的纯化方法,-1,Rizzi M, Erlemann P, Bui-Thanh NA, Dellweg H. Xylose fermentation by yeast 4. purification and kinetic studies of xylose reducetase from,Pichia stipitis,. Appl Microbiol Biotechnol. 1988, 29: 148-154.,Dellweg,研究小组的纯化工艺,木糖还原酶的纯化方法,-2,Mayr P, Petschacher B, Nidetzky B. Xylose Reductase from the Basidiomycete Fungus,Cryptococcus flavus,: Purification, Steady-State Kinetic Characterization, and Detailed Analysis of the Substrate Binding Pocket Using Structure-Activity Relationships. J. Biochem. 2003, 133: 553-562.,Nidetzky,研究小组的代表性纯化工艺,木糖还原酶的纯化方法,-3,其他研究小组的代表性纯化工艺,Granstrm T, Airaksinen U, Wu XY, Leisola M.,Candida guilliermondii,grows on rare pentoses-implications for production of pure xylitol. Biotechnology Letters. 2002, 24: 507-510.,工艺路线设计,亲和层析,DEAE,离子交换层析,（生化中心）,Phenyl,疏水层析,（生化中心）,凝胶过滤层析,优点：特异性强、纯化倍数高,缺点：自己制备,离子交换层析的优化,pH,值,仅在,6.5-7.5,之间稳定,盐浓度,载量,再生条件,最大载量：,5ml,酵母培养液,/ml,介质,1M NaCl,，,20,乙醇,1M NaCl,，,20,乙醇，,1M NaOH,收率由,70,降到,50,收率可保持在,70,疏水相互作用层析的优化,盐浓度,停留时间,载量,首先对介质进行筛选,Phenyl-1,Phenyl-2,Phenyl-3,工艺整合层析谱图,离子交换层析谱图,疏水相互作用层析谱图,介质：,DEAE (,生化中心,),；,柱子：,13cm5.5cm I.D.,；,CV,300ml,流速：,15ml/min,；,进料量：,1.2-1.3L,酵母培养液,介质：,Phenyl,（生化中心）；,柱子：,9cm4.0cm I.D.,；,CV,113ml,流速：,15-18ml/min,；,进料量：,1.2-1.3L,酵母培养液,产品鉴定：,HPSEC-UV,Conditions: TSK G3000 SW (300 mm7.5 mm I.D.) with TSK GPW Guardcolumn (75 mm7.5 mm, I. D.); eluted by PBS (0.1 M PB added with 0.1 M Na,2,SO,4, pH 6.8) at room temperature (20-25 C) with 0.5 ml/min flow rate; 100 ml of injection volume.,离子交换层析主要活性峰,疏水层析主要活性峰,产品鉴定：,SDS-PAGE,1,2,3,4,1,：酵母破碎液上清,2,：离子交换层析主要活性峰,3,：疏水相互作用层析主要活性峰,4,：,marker,胶浓度：,15%,染色方法：银染,每个条带上样量为,2,m,g,31.0kDa,43.0kDa,66.2kDa,97.4kDa,兔肌乳酸脱氢酶的纯化,Hitrap,的高效使用,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,所建立的工艺最终产品中含有苹果酸脱氢酶，如何去除,组分,IV,的综合利用,提取工艺,170kDa,130kDa,95kDa,72kDa,55kDa,43kDa,34kDa,26kDa,a,2,-,巨球蛋白,铜蓝蛋白,C1,酯酶抑制剂,转铁蛋白,白蛋白,ATIII,结合珠蛋白,载脂蛋白,A1,a,1,-,抗胰蛋白酶，,IgG,转铁蛋白,IgG,HSA,结合珠蛋白,a,1,-,抗胰蛋白酶,Apo-A1,铜蓝蛋白,组分,IV,溶出蛋白在离子交换层析上的行为,乙肝病毒表面抗原的纯化,工作特点：用机理研究中的发现指导于实际生产中,调节溶剂环境去除表面活性剂,调节盐的类型减少,HBsAg,在疏水层析中的损失,调整整体工艺减少,HBsAg,在纯化过程中的聚集和解聚,EV71,病毒颗粒的纯化,不同工艺制备得到的纯品分析,1-maker,；,2-,改进后工艺；,3-,改进前工艺,25,C,目标产物,15,C,目标产物,5,C,目标产物,EV71,纯化工艺的建立以及纯品的获得使得后续的动物实验可以开展，推动其临床前研究,170kDa,130kDa,95kDa,72kDa,55kDa,43kDa,34kDa,26kDa,1 2 3,蛋白质变性,蛋白质变性过程,蛋白质变性温度,蛋白质在一定的温度下会变性。在一个热变性过程中，有,50%,的蛋白质分子变性（此时）时的温度被称为变性温度（,unfolding / melting / denaturation / transition tmeperature,）。蛋白的热变性过程通常是吸热的。一些蛋白质的变性温度值列于表,1,中，大都在,40-80 ,之间。,蛋白质聚集,最近的研究表明聚合可能发生于蛋白质特定过渡态构象，而不是非特异性的结合。聚集过程大体分为三个步骤：引发，传递和终止。蛋白质的聚合可以有很多的物理因素诱导，比如温度，离子强度，涡流，表面或界面吸附等等。这些因素可以增加蛋白的疏水表面，会导致蛋白质的聚合。很多试剂都可以用来检测蛋白质聚合的机理。,SDS,，盐酸胍，脲等变性剂可以用来验证蛋白质是否为共价键聚合。用这种方法证实的非共价聚合蛋白包括胰凝乳蛋白酶原，胰岛素和白介素,1,。,DTT,，巯基乙醇等还原试剂可以用来确定蛋白质的聚合是否涉及二硫键。,Simplified model of correct folding versus misfolding and aggregation. The correct protein folding pathway (1) often competes with misfolding (2) and aggregation (3). Aggregation occurs among intermediates with exposed hydrophobic patches, which are buried in the correctly folded protein (blue lines, hydrophilic solvent-exposed parts of the protein; red lines: hydrophobic patches).,蛋白质的化学稳定性,脱酰胺二硫键的断裂和形成水解异构化琥珀酰化非二硫键交联去糖基化美拉德反应,多种化学反应在同一蛋白质上同时发生，这使得分离和鉴定蛋白质的降解产物非常困难。纤维原细胞生长因子（,bFGF,），在溶液中发生多种化学变化，多聚，琥珀酰化，水解和聚合。,氨基酸在蛋白质中的位置对于其化学反应性非常重要。蛋白质内部存在的水分子数量有限，如果一些氨基酸残基在蛋白内部且具有柔韧性，那么这些氨基酸残基可能具有反应性。蛋白质内部许多氨基酸的化学反应需要一定的分子柔韧性，所以变性蛋白或者具有高柔韧性的小肽分子的化学反应性要高于天然蛋白。,脱酰胺反应,Asn,和,Gln,是蛋白质中两个最容易发生脱酰胺反应的残基，其中,Asn,更不稳定。蛋白质或肽的水溶液中,Asn,的脱酰胺的速率可以比肽键水解速率更快。,牛胰核糖核酸酶,A,中的,Asn74,的脱酰胺速率在,pH5.5-7.7,范围内随,pH,值的增加而加快。,pH,值,在蛋白中的相对位置,相邻残基,人,表皮生长因子,（,hEGF,）有三个脱酰胺位点（,Asn,1,，,Asn,32,，,Gln,43,），其中,Asn,1,由于其相对较高的运动性，在中性和,碱性,条件下最易发生脱酰胺反应。,增加相邻氨基酸残基的尺寸和分支可以降低脱酰胺速率，最慢的反应速率是,Gly,为相邻氨基酸残基时脱酰胺速率的,1/70,氧化,侧链中的,His,，,Met,，,Cys,，,Trp,和,Tyr,残基可以发生氧化反应。微量的金属离子可以催化这些位点上的氧化反应；氧化剂和光线照射可以加强氧化。,人生长激素在含有,0.4%,氧气的容器中即被氧化。,Met,容易被氧化的原因可能是它是蛋白质分子中最具柔韧性的非极性或中等极性残基。,Met,中的硫醚键可以被氧化成两种形式：亚砜或砜。,Met,先被可逆的氧化为亚砜，在剧烈的条件下可被进一步不可逆的氧化为砜。氧化反应的速率依赖于发生反应的基团在蛋白质中的位置。人重组甲状旁腺激素中在中，,Met,18,和,Met,8,都可以被氧化为亚砜，但是,Met,18,更易,发生,氧化。,二硫键的断裂和形成,蛋白中自由的,Cys,残基很容易被氧化形成二硫键连接，或者造成二硫键的交换，导致蛋白的聚集或聚合。,半胱氨酸残基被埋藏于蛋白质内部，则它们很少具有反应活性。,蛋白质中的巯基二硫键交换发生在离子化的巯基和二硫键之间。巯基二硫键的交换速率由亲和性巯基的带电程度决定，因此反应速率随着,pH,值的增加而增加，直到,pH,值超过巯基的,pK,值。,即使蛋白中没有自由的,Cys,残基，二硫键的错位也会发生，这会导致蛋白质的聚集。比如冷冻干燥的胰岛素，它只有三个二硫键，但可以通过,消除一个完整的二硫键而形成二硫键错位的聚集体。,非二硫键交联,蛋白质可以通过非二硫键的途径形成共价的二聚体或聚合物。,胰岛素在存储过程中会发生这种变化。在形成胰岛素二聚体和脱酰胺胰岛素的过程中都涉及环酐中间产物。胰岛素的二聚体主要通过在,