实验一 碱变性法抽提质粒DNA

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,梁晓红 王晓燕,2011-6,医学分子生物学实验,基因克隆实验技术部分,1,共,100,分,实验设计,60%,考勤,+,实验报告,40%,实验设计（,30004000,字）：,选题：结合自己的专业，利用基因工程技术,内容：,1,）立题依据；,2,）原理；,3,）实验材料；,4,）实验方法；,5,）预期结果；,6,）参考文献（,3,篇）,评分标准：,1,）项目完整,35,分；,2,）创新性,15,分；,3,）可行性,5,分；,4,）合理性,5,分。,2,注意事项,1,.,分组（,4,人,/,组）,2.,隔离衣,3.,离心机、移液器等使用,3,Restriction enzymes:,选（分）,切,接,转筛扩,重组,DNA,技术的基本过程,4,总体实验安排,上午,下午,1,碱变性抽提质粒,DNA,核酸浓度和纯度分析,核酸电泳及分子量测定,质粒,DNA,的酶切,2,感受态细胞的制备,质粒,DNA,的酶切产物电泳,试剂盒回收,DNA,目的基因与载体的连接,3,重组子筛选、鉴定方法,蓝白斑筛选,真核基因组,DNA,抽提,1,连接子的转化,真核基因组,DNA,抽提,2,4,菌落的,PCR,鉴定,PCR,产物的电泳,5,实验一,碱变性法抽提质粒,DNA,6,质粒（,plasmid,）,质粒,(Plasmid),是一种染色体外的稳定遗传因子,为,双链、闭环的,DNA,分子,并以,超螺旋状态,存在于宿主的细胞质中。,质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并,表达所携带的遗传信息,。,质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。,7,存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链,DNA,分子。,（,1,）,8,质粒在细胞内的复制一般有两种类型,:,严紧控制型,(,Strengent control),：,复制受宿主细胞的严格调控，拷贝数低；,松驰控制型,(Relaxed control),：复制不受宿主细胞的调控，拷贝数高,适用于基因工程中做载体。,9,分离质粒,DNA,的方法,碱变性法；,煮沸法；,SDS,法；,羟基磷灰石层析法等,10,一、实验目的,通过本实验掌握碱变性法提取质粒,DNA,。,11,二、实验原理,在,pH 12-12.5,时，线性,DNA,被彻底变性，但共价闭环质粒,DNA,虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。,当在溶液体系中加入,pH4.8,的,NaAC,时，溶液恢复中性，质粒,DNA,迅速复性，染色体,DNA,不能恢复，形成网状结构，通过离心可以把变性的染色体,DNA,和蛋白,-SDS,复合物沉淀分离出来,。,质粒,DNA,细菌染色体,DNA,分子量小,分子量大,超螺旋,线性双螺旋,12,三、实验仪器、材料与试剂,（一） 仪器,1.,恒温摇床,2.,超净工作台,3.,高压灭菌锅,4.,高速离心机,5.,微量取液器,13,（二） 材料,大肠杆菌,JM109,（,pBR322-HBV,）,（三） 试剂,1. LB,培养基,2. LA,培养基（,LB+Amp,）,HBV,片段,pBR322-HBV,14,四、实验步骤,甘油保存的菌种,JM109-PBR322-HBV,涂布于,LA,琼脂平板,37,，培养过夜,挑取单克隆于,2ml LA,液体培养基中,37,，,220rpm,振荡培养过夜,取,1.4ml,菌液入,1.5ml,的,EP,管中,12000rpm,、离心,30s,，弃上清,重复上述步骤一次,100ul,溶液,I,悬浮菌体（,充分振荡,),加入,200uL,溶液,II,颠倒混匀,5,次（,轻柔,），冰浴,3,5min,。,15,(,出现拉丝现象,),加入,150l,溶液,III,，温和混匀,10s,，冰上放置,3,5min,。,(,云雾状,沉淀,),12000rpm,离心,5min,，取上清到一新,Ep,管,(,约,440l,),上清加,等体积氯仿,/,异戊醇（,24/1,），,颠倒混匀,2min,，,12000,rpm,离心,5min,。,(,分离蛋白质及核酸，,氯仿可使蛋白质变性，,异戊醇防止发泡,),取上,清,(,约,400l ),至,新,Ep,管中。,加入,2,倍体积,100%,冰乙醇,混匀，室温放置,5min,。,12000 rpm,离心,5min,。,(,沉淀质粒,DNA,),弃上清,，加入,70,乙醇,1ml,，颠倒漂洗,（保持沉淀在管底）,，,12000 rpm,离心,3min,。,(,清除残余离子,),16,弃上清,，将,Eppendorf,管于吸水纸上倒置,1min,，室温放置,5min,加,40,l,TE,（,pH8.0,，含无,DNA,酶的,RNA,酶,20g/ml,），溶解,DNA,，短暂混匀，室温放置,30min,以消化,RNA,。,取,10l,进行电泳，其余放置用于内切酶酶切实验，或,-20,贮存。,17,注意事项,碱变性的时间严格控制,酸中和的时间可以适当延长,离心取上清时，不要吸取中间的蛋白层,漂洗沉淀时不要将沉淀冲掉,18,溶液,50mmol/L,葡萄糖,; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 10mmol/L EDTA(pH 8.0),(,主要作用,：,Solution I,中的,EDTA,可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的,DNA,酶的活性，对,DNA,起到保护作用。加入,solution,后一定要充分打散菌体。,),溶液,(pH 12.6),0.2mol/L NaOH ;1%SDS (,现用现配,),(,主要,作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性,. Solution II,要新鲜配置,NaOH,可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入,solution II,后放置时间不要超过,5min,，以免变性质粒不易复性,),溶液,(pH 4.8) 100ml,5mol/L NaAc 60ml;,冰醋酸,11.5ml;,双蒸水,28.5ml,(,作用：中和碱液，质粒,DNA,复性，变性蛋白,SDS,线性,DNA,沉淀,),19,氯仿,/,异戊醇（,24,：,1,）,：,氯仿可使蛋白质变性，异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫,;,无水乙醇,：除去,DNA,水化层，使,DNA,沉淀,TE,（,pH8.0,）,:,10mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 1mmol/L EDTA(pH 8.0),(,溶解,DNA),20,离心,&,沉淀,漩涡混合器,21,云雾状沉淀,22,