实验一 叶绿体色素的分离及理化性质测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验材料,:,菠菜叶片,实验一、叶绿体色素,提取,分离和,理化,性质,植物色素：,1,）,脂溶性色素：叶绿素、类胡萝卜素等,有机溶剂提取，乙醇或丙酮,2,）,水溶性色素：液泡中花青素,、,黄酮类物质,实验目的,：,1,）掌握叶绿素的提取方法,2,）,了解叶绿素的理化性质,1,叶绿体中含有,绿色素,(,包括叶绿素,a,和叶绿素,b,，酯类化合物,),和,黄色素,【,包括胡萝卜素,(,烃类,),叶黄素,(,衍生的醇类,)】,两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为,色素蛋白复合体，不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。,亲水的,卟啉环的“头部”,:,镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，,是亲水的，可以与蛋白质结合,。,亲脂的,叶绿醇的“尾巴”,:,叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，,是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性,。,叶绿体色素提取原理,：,2,乙醇提取叶绿体色素,：,1),取菠菜叶片洗净、擦干、剪碎、混匀，称,2g,左右,，放入研钵中。,2),加入少量,石英砂,及,碳酸钙粉,，加,1,2,滴管,95%,乙醇，研磨至糊状,;,再加,10,15ml,95%,乙醇，,提取,1,3min,，过滤于三角瓶中,(,滤纸用乙醇润湿）,3),残渣用,5ml,95%,乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中,。,水提取叶绿体色素,：,取,2g,剪碎的新鲜叶片，放入少量,石英砂,(,不加碳酸钙粉,),，用水研磨。先加,2ml,蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水,20ml,，搅匀，,不过滤,。,3,水 提 取 液,暗 光,乙 醇 提 取 液,暗 光,注意：,色素乙醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能做光破坏实验，否则在短时间之内效果不明显。,1.,光对叶绿素的破坏作用,4,因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相,(,流动相和固定相,),间具有,不同的分配系数,，所以它们的,移动速度,不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。,2.,提取液中各成分分离：,色层分析的原理：,吸附剂：滤纸,推动剂：石油醚,:,丙酮,:,苯,(10:2:1),叶绿体色素的,结构,决定,极性,不同，因而在滤纸上的,迁移速率,不同。,5,1),圆形定性滤纸,1,张,用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔,;,2),取一张窄滤纸条,沿纸条长度方向涂色素，限制在,0.5cm,，垂直风干，重复涂抹,10,次。,涂抹色素要适量，量多拖尾，量少色带看不清。,技巧方法：将浓色素滴到玻璃皿盖上，涂抹纸片,3),沿长度方向卷成纸捻,;,4),纸捻带,有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中,，,色素一端与滤纸平齐,(,勿凸出,),。,2.,提取液中各成分分离：,6,4),康维皿放置培养皿内，中央室中加,4/5,以上的推动剂。,5),把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入 推动剂中。盖好培养皿,(,为什么,),。,6),推动剂到达滤纸边缘,1/2,时，取出滤纸，风干。,7),剪下一部分滤纸，附到实验报告中。,7,注意事项：,1,、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。,细，匀，直，浓。,2,、涂抹的色素要适量，量多易拖尾，量少色带弱,3,、纸捻卷紧；,4,、色素涂抹的宽度不要超过纸条的二分之一；,5,、中心孔小又圆；平齐，勿突出；,6,、分离时一定要盖严培养皿盖，防止推动剂蒸发。,7,、实验结束后，推动剂倒入到专用回收桶中。,8,从外往内分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色。,实验结果：,胡萝卜素分子最小，单纯的碳氢化合物，溶解度最大，扩散速度最快；,叶黄素中有两个,-OH,、极性增加，其分子量稍大于胡萝卜素，低于叶绿素，所以扩散速度仅次于胡萝卜素；,叶绿素,a,、叶绿素,b,都有一个亲水的“头部”，扩散速度慢；,叶绿素,a,扩散速度快于叶绿素,b(,醛基,),，叶绿素,b,扩散的最慢 。,可渗透物质相,似相溶原理,色素分子的结构和极性共同决定了迁移率的大小,9,取一支,20ml,的刻度试管，加入,5ml,浓的叶绿素乙醇提取液，观察透射光和反射光的颜色。,植物叶片是否发射荧光？为什么，如何进行检测？,*观察完后保存好试管内提取液，准备皂化反应,叶绿素酒精溶液的荧光强度较强，约达其吸收光的,10,左右，而鲜叶的荧光强度较低，只占其吸收光的,0.l,1,。,透射光,下为翠绿色,反射光,下为棕红色,3,、叶绿素荧光现象,620720nm,10,4,、皂化作用（绿色素与黄色素的分离）,C32H30ONMg,COOCH,3,COOC20H39,+ 2KOH,C32H30ON4Mg,COOK,COOK,+ CH3OH + C20H39OH,叶绿醇,甲醇,叶绿素是一种二羧酸,-,叶绿酸,和,甲醇和叶绿醇,形成的复杂,酯,，可与,碱,起皂化反应，生成,醇,和叶绿酸的,盐,，产生的盐能溶于水，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。,11,操作步骤：,1,、叶绿素荧光观察所有试管中，加入,1.5ml 20%KOH-,甲醇溶液，充分摇匀；,2,、加入,5ml,苯，摇匀 ；,3,、沿管壁加入适量蒸馏水,1-1.5ml,，只需轻微摇动。,注意：,如果分层后下部的溶液浑浊，可以剧烈摇动，对试管水域加温，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。,黄色素,绿色素,12,5,、吸收光谱的观察,在,光谱中的红光与蓝紫光的部位就会出现很深的黑带,，表明这些光线已被叶绿素强烈吸收；而,绿光部位没有黑带，也就是未被吸收,。,胡萝卜素与叶黄素,主要吸收蓝紫光,，基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。,如果在阳光与三棱镜之间插入一支盛有叶绿体色素的试管：,因此，叶绿素呈现绿色。,13,叶绿素中的,Mg,2+,被,H,+,所取代而成,褐色的去镁叶绿素,铜取代,H,+,形成,绿色铜代叶绿素,，相对稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本,6,、,H,+,和,Cu,+,对叶绿素分子中,Mg,+,的取代作用,取出,1/2,放到,3,CK2,用乙醇稀释,3,倍,6ml,取出,1/3,放到,2,CK1,加,5,盐酸,1,滴，摇匀,加入醋酸铜粉末少许,不断摇动，加热或手暖,3,支试管比较观察颜色变化,1,试管,乙醇色素提取液,2ml,褐色去镁叶绿素,绿色铜代叶绿素,14,1.,填写记载表、分析、讨论、注意事项,2.,实验报告：下周三之前交到,B-129,房间,3.,下次实验：叶绿体色素的定量测定,B-120,4.,洗刷干净，器皿摆放整齐。,5.,废液回收：,含苯色素溶液及推动剂倒入专用回收桶中；,乙醇提取液倒入到专用回收桶中。,15,