生物制药学第五章固相析出分离法

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第五章 固相析出分离法,结晶法,（晶体）,沉淀法,（无定形固体）,固相析出分离法：,改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。,思考对比,固相析出分离法与溶液萃取分离法有何异同？,盐析法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,其他沉淀法,固相析出分离法,盐析法,有机溶剂沉淀法,其他沉淀方法,结晶法,等电点沉淀法,成盐沉淀法,表面活性剂沉淀法,高分子聚合物沉淀法,亲和沉淀法,第一节 盐析法,一、基本原理,盐析法是利用各种生物分子在,浓盐溶液,中,溶解度的差异,，通过向溶液中引入一定数量的,中性盐,，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。,蛋白质溶液,加入中性盐,低盐，,盐溶,高盐，,盐析,两性电解质，静电力作用，相互排斥；,形成水化膜，避免相互碰撞。,（1）生物大分子在水溶液中的特性,（2）作用原理,破坏水化膜,中和电荷,（3）盐析过程,“盐溶”低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。,“盐析”高盐浓度下，蛋白质溶解度下降。,蛋白质在水中的溶解度与离子强度的关系,Cohn经验公式：,lg,S,= - Ks ,S 蛋白质溶解度，g / L；, 盐离子强度，, = ci Zi 2，,ci 盐离子强度，mol / L；,Z i i 离子化合价；, 常数； Ks 盐析常数。,Ks盐析法（溶解度剧烈下降）,在一定的pH和温度下，,改变盐离子强度,（浓度）进行盐析,分辨率不高,用于提取液的前期分离,盐析法（溶解度变化缓慢）,一定的盐离子强度下，,改变pH和温度,进行盐析,分辨率比Ks盐析法高,用于后期分离,二、影响盐析的因素,无机盐种类,溶质（蛋白质等）种类,pH值,温度,蛋白质浓度,a、盐析作用规律,半径小的高价离子作用较强，半径大的低价离子作用较弱（,感胶离子序,）。,阴离子,：柠檬酸根酒石酸根SO42-F-IO3- H2PO4- ,CH3COO- Cl- ClO3-Br- NO3- ClO4- I- CNS-,阳离子,：Th4+Al 3+ ,H+Ba2+Sr2+ ,Ca2+ ,Cs+ Rb+NH4+K+ Na+Li+,1）无机盐的种类,一般高价阴离子盐析作用较好,b、用盐的参考要求,盐析作用要强,较大的溶解度，受温度影响小,必须是惰性的,来源丰富、经济,c、硫酸铵特点,优点：,价廉，溶解度大,（,767g/L,）,，随温度变化小,缺点：,水解变酸；高pH释氨，腐蚀；残留量对产品有影响。,硫酸铵使用注意事项:,1、硫酸铵中常含有少量的,重金属离子,，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用H2S处理.,2、高浓度的硫酸铵溶液一般,呈酸性,（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水调节至所需PH。,3、硫酸铵,容易吸潮,，计算饱和度需注意,。,蛋白质种类不同（,和 Ks不同,），,盐析沉淀所需的无机盐量也不同。,先后加入不同量的无机盐可分级沉淀不同蛋白质。,2）溶质（蛋白质等）种类,蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低；,蛋白质浓度小，盐的用量大，共沉作用小、分辨率高,3）蛋白质浓度的影响,一般常将蛋白质浓度控制在23为宜。,适当稀释，可使盐析分布曲线互相重叠的两个,蛋白质分级沉淀,。,4）温度的影响,一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降。,必须考虑到蛋白质对热稳定性。,-,淀粉酶、蛋白酶,磷酸盐沉淀碳氧血红蛋白,5）pH的影响,影响蛋白质,表面净电荷,的数量,。,通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好。,在高盐溶液中蛋白质等电点的偏移现象。,盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：,在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。,1. 盐析用盐的浓度表示,（1）加硫酸铵的饱和溶液,三、盐析操作,Va：加入的饱和（NH4 )2S04 体积,V0：蛋白质溶液原始体积,P1、P2：分别表示初始和最终溶液的饱和度，,（2）直接加固体硫酸铵,在工业生产溶液体积较大时，或需要达到较高的硫酸铵饱和度时，可采用这种方式。为达到所需的饱和度，应加入固体硫酸胺的量，可查表或由下式计算而得：,X：1L溶液需加人固体（NH4 )2SO4 的质量（g)；,G：饱和溶液中的盐含量，0时为515，20为513；,A：常数，0时为0.27， 20为0.29。,2.盐析方法和注意事项,1）分级盐析法,注意：试验用提取物的浓度应与生产时一致；,在高盐浓度下，有的生物活性物质的活力会受到抑制。,2）重复盐析法：用较低的盐饱和度多次重复盐析。,3）反抽提法：先共沉淀，再用稀盐溶去杂蛋白。,大肠杆菌,提 取 液,上清50%,饱和硫酸铵,33%饱和,硫酸铵,悬于12%饱和,硫酸铵中,沉淀,上清,上清,弃去,沉淀,弃去,沉淀,酶,大肠杆菌RNA聚合酶的制备,3）盐析注意事项,沉淀反应在缓冲溶液中进行；,盐析完全需要一定时间；,能否多次盐析靠试验确定；,盐析后应及时脱盐（常用透析）。,防止非均态出现；,防止低温增溶（少数在0-10）；,注意分离方法与介质的密度和黏度的关系。,脱盐的方法,四、盐析方法的应用,盐析法由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于,蛋白质,、,酶,、,多肽,、,多糖,、,核酸,等物质的初级分离。,胸腺提取液,加热去杂蛋白,上 清 液,丙 酮 粉,丙酮沉析(-10,),上 清 液,磷酸盐缓冲液中溶解、,加,硫酸铵饱和度为0.25,盐 析 物,加,硫酸铵饱和度为0.50,超 滤,胸腺素,硫酸铵分级盐析法粗提胸腺素工艺流程,沉淀+PBS,继续纯化,上清液含,-球蛋白,沉淀含,-球蛋白,加饱和硫酸铵达45%饱和度,加饱和硫酸铵,加饱和硫酸铵达20%饱和度,血浆+PBS,上清液含,清蛋白,沉淀+PBS,上清液,沉淀含,纤维蛋白,上清液,沉淀含,-球蛋白,加饱和硫酸铵达30%饱和度,上清液为,-球蛋白,沉淀为,-球蛋白,加饱和硫酸铵达30%饱和度,硫酸铵分级盐析分离血浆中主要蛋白质操作流程,第二节 有机溶剂沉淀法,向水溶液中加入一定量,亲水性,的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。,优点：,产品更纯净；易分离；分辨能力比盐析法高；沉淀不用脱盐。,缺点：,易使蛋白质变性；需在低温下进行；易燃易爆；成本高，有一定毒性。,A,降低溶剂介电常数,（介电常数D有机 D水）,，,减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。,B,破坏水化膜：,由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。,C,相反力：,疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。,一、有机溶剂沉淀法基本原理,（,p174,）,有机溶剂沉淀法机理,降低介电常数,破坏水化膜,二、影响沉淀效果的因素,有机溶剂种类及用量,pH值,温度,无机盐含量,金属离子,样品浓度,1、有机溶剂种类及用量,选择原则：,水溶性要好（与水无限混溶）,介电常数要小,致变性作用要小,毒性要小、挥发性适中,用量计算：,2、溶液pH值：,目标蛋白与杂质带有相同的电荷，一般pI附近,3、温度：（预冷）,低温防止变性，有利于提高收率（溶解度下降）；,（有机溶剂溶于水放热）,4、无机盐含量:,离子强度低有利于沉淀，0.010.05mol/L,5、金属离子助沉淀作用：,Ca2+、Zn2+,等多价阳离子。,6、样品浓度: 0.52%,稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小,浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究,-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液 加乙醇（70%）搅拌 -淀粉酶,* pH影响,收率% 酶活,收率,酶活,6.5 pH,* 适宜的pH 5.6 6.0,* 温度影响,收率% 酶活,酶活,收率,10 20 T,* 适宜的温度10 20 ,有机溶剂沉淀实例,第三节 其他沉淀方法,1.等电点沉淀,调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为,等电点沉淀,。,原理：,蛋白质是两性电解质，当溶液,pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0,，,双电层破坏,和,水化膜变薄,，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。,等电点沉淀法只适用在等电点时溶解度很低的两性生化物质，如酪蛋白。,操作时的注意事项：,（1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“,漂移”,，阳-高，阴-低,（2）溶质的稳定性,（3）由于在,等电点附近,，,溶质仍然有一定的溶解度，,等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法,联合使用,。,2、成盐沉淀法,金属离子沉淀、有机酸类复合盐沉淀,3、亲和沉淀,加入载体-配基复合物,4、高分子聚合物沉淀法,PEG、Dextron、PVPP,等。,5、表面活性剂沉淀法,几种主要沉淀方法比较,各种沉淀方法应用范围,盐析法,：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。,有机溶剂沉淀法,：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。,等电点沉淀法,：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。,非离子多聚体沉淀法,：用于分离生物大分子。,生成盐复合物沉淀,：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。,选择性沉淀,（热变性或酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。,固体有两种状态：,结晶,和,无定形,结晶,：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则,无定形固体,：析出速度快，粒子排列无规则,结晶的概念：,溶液中的溶质在一定条件下，因,分子有规则,的排列而结合成晶体。,特征：,晶体的化学成分均一，具有各种,对称,的晶体，离子和分子在空间晶格的结点上呈,规则的排列.,第四节 结 晶,典型的晶体结构,只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有,良好的选择性,。,通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到,纯度较高,的晶体。,结晶过程具有,成本低、设备简单、操作方便,，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的,精制,。,结晶操作的特点,结晶包括三个过程：,过饱和溶液的形成；,晶核的形成；,晶体的生长。,溶液达到过饱和是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。,一、结晶过程,饱和溶液,过饱和溶液,饱和曲线和过饱和曲线,二、过饱和溶液的形成方法,(1)溶剂蒸发法,(2)温度诱导法,(3)盐析结晶法,(4)透析结晶法,(5)有机溶剂结晶法,(6)等电点法,(7)微量扩散法,(8)化学反应结晶法,(9)共沸蒸馏结晶,三、 提高晶体质量的途径,晶体质量包括三个方面的内容：,1、晶体大小,2、晶体形状,3、晶体纯度,晶核的形成,晶核的形成是一个,新相,产生的过程，需要消,耗一定的能量才能形成固液界面。,(1) 初级成核:过饱和溶液中的,自发成核,现象（,不稳定区,）。,(2) 二次成核：向稍微过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生,机理:,附着在晶体表面的微小晶体受到,剪切,作用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。,在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，这种现象称为,晶体生长,。晶体生长速度也是影响晶体产品粒度大小的一个重要因素。如果,晶核形成速度大大超过晶体生长速度,，则过饱和度主要用来生成新的晶核，因而得到细小的晶体，甚至无定形；如果,晶体生长速度超过晶核形成速度，,则得到粗大而均匀的晶体。,晶体的生长,1、影响晶体大小的因素,（1）过饱和度,低,过饱和度,高,成核速度大于晶体生长的速度（,细小,）,过饱和度,低,成核速度小于晶体生长的速度（,粗大,）,（2）冷却的速度,缓慢,快速,冷却能达到较高的饱和度，得到,细小,晶体,缓慢,冷却能达到较低的饱和度，得到,粗大,晶体,（3）搅拌速度-,适当,适当搅拌,加快扩撒，提高晶体长大的速度，,搅拌,过快,，则愈快愈逾小,（4）晶种-控制晶体形状、大小和均匀度,2、影响晶体形状的因素：,过饱和度、改变溶剂体系、杂质,如：普鲁卡因青霉素在水中结晶得方形晶体；在乙酸丁酯中得到棒状晶体,3、影响晶体纯度的因素：,母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布,“晶簇”,重结晶：,是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作,。,重结晶溶剂选择：,1）对溶质的溶解度大，外界条件（T、pH）改变，溶解度明显减小；,2）对杂质溶解性好；,3）毒性低、沸点较低。,重结晶,生物物质重结晶：,蒸馏水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇等,Thank You !,