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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫沉淀类实验,1,教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生,实验课时：6学时,课程类型：专业实验课,课程要求：必修,每组人数：2人,2,实验目的与要求,掌握单向琼脂扩散试验、双向琼脂扩散试验、对流免疫电泳的原理、结果分析及应用；,熟悉火箭免疫电泳、免疫电泳的原理及应用。,3,实验内容,单向琼脂扩散试验,双向琼脂扩散试验,对流免疫电泳,示教：,火箭免疫电泳,免疫电泳,4,一、单向琼脂扩散试验,5,实验原理,：,将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，可从用不同浓度标准抗原制成的标准曲线上，查出待检样品中抗原的含量。,一、单向琼脂扩散试验,6,试剂与器材,商品IgG、IgM、IgA单向琼脂扩散板；,37恒温箱、湿盒、可调微量加样器等；,待检血清。,方法,分别取商品IgG、IgM、IgA单向琼脂扩散板1块，按说明书操作。,用微量加样器分别准确吸取不同稀释度待测血清10mL加于孔内。,将琼脂板放入湿盒中，置于37恒温箱扩散24小时。,一、单向琼脂扩散试验,7,注意事项：,加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察；,实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备。,一、单向琼脂扩散试验,结果观察,分别量取各孔样品沉淀环的直径，从相应说明书提供的参考标准曲线，计算待检血清中各种免疫球蛋白的含量。,8,二、双向琼脂扩散试验,9,实验原理,：,在含有电解质的琼脂中，抗原抗体分子互相弥漫扩散，当比例合适时可出现肉眼可见的白色沉淀线。沉淀线的形状、位置，与抗原的浓度、扩散速度相关。,二、双向琼脂扩散试验,10,试剂与器材,含15g/L生理盐水的琼脂糖,待检血清、抗人血清,载玻片、湿盒、吸管、打孔器、37恒温箱、可调微量加样器等,方法,制板,：用510mL吸管吸取溶化的含15g/L生理盐水的琼脂糖，于一洁净的载,玻片；,打孔：,待琼脂板凝固后，用直径3mm的打孔器打孔，每孔之间的距离约4,5mm，根据需要，可打成呈梅花状、三角状的孔；,加样：,用可调微量加样器根据需要在不同孔内加入待检血清和抗人血清10mL；,扩散：,将琼脂糖凝胶板放湿盒中，置37温箱中24h后，取出观察结果。,二、双向琼脂扩散试验,11,注意事项：,加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察；,制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖时要避免产生气泡；,打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。,二、双向琼脂扩散试验,结果观察：,沉淀线的位置、数目与形状等。,图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系,a、b：抗体 A、A、B：抗原A、B完全不同 A、A部分相同,12,三、对流免疫电泳,建立在双向琼脂扩散试验的基础上，通过电流，使蛋白质抗原、抗体在电场中作定向加速度双扩散，从而加速沉淀的形成。,13,实验原理,：,在一定的离子强度、pH8.4以上的缓冲液中，大多数抗原解离带负电，在电场中向阳极移动，而抗体大部分是IgG，其等电点与环境中的pH接近，很少解离。另外，由于分子量大，加上电渗作用缓慢向阴极移动，在短时间内，在两孔之间或抗体另一侧形成沉淀线。,三、对流免疫电泳,14,试剂与器材,1.5%巴比妥缓冲液琼脂糖,待检血清、抗人血清,0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液,载玻片、吸管、打孔器、可调微量加样器、电泳仪、电泳槽等,方法,制板,：用510mL吸管吸取溶化的含15g/L生理盐水的琼脂糖，于一洁净,的载玻片；,打孔：,待琼脂板凝固后，用直径3mm的打孔器打孔，每孔之间的距离约,45mm，根据需要，可打成呈梅花状、三角状的孔；,加样：,在孔中相向加入10mL抗原和抗体 ；,电泳：,将抗原置于阴极侧，抗体置于阴极侧，,以4V/cm电压电泳30min1h。,三、对流免疫电泳,15,结果观察：,关闭电源，打开电泳槽，观察沉淀线的位置、数目与形状等。,注意事项：,加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察；,制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖时要避免产生气泡；,孔距约0.5cm左右，太远看不到实验现象。,三、对流免疫电泳,16,示 教,火箭免疫电泳,将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，冷凝后，在琼脂板的一端打一排小孔，分别加入一定量的待测样品进行电泳。抗原在电泳过程中，与抗体相遇，在比例合适时可形成锥形沉淀峰，其形状如火箭，故名火箭电泳。火箭峰的高度与抗原含量成正比，以峰高为纵坐标，已知的抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线图，就可知待检样品中抗原的含量。,17,示 教,免疫电泳：,免疫电泳技术是利用蛋白质分子量以及其所带电荷的不同，在电场作用下，蛋白质各组分迁移速度有别的性质，将蛋白质各组分分离，然后与槽中之抗体进行双向扩散，相应的抗原、抗体形成一条沉淀弧，从而形成一系列沉淀弧。根据沉淀弧的形状和位置，可对蛋白质的不同组分进行分析研究。,18,
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