chapter+12-15+nucleic+acid

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 12-15,Basic principles of nucleic acids,Structure,，,biological functions,，,genetics,第五章,核酸,第一章 核酸通论,1,、核酸发现及研究历史,3,、核酸的生物学功能,2,、核酸的类型,在生物细胞核中存在着一种能被碱性染料着色的螺旋集缩体。,是由核酸、 组蛋白、非组蛋白等组成，称此物质为染色体。,经典遗传学认为，染色体和基因（遗传因子）间有平行现象。,基因存在于染色体上，基因在遗传中具有完整性，随染色体的分裂、配对而进行独立的分配。,1.1,染色体与基因,Bacterial DNA exists as a compact,mass in the center of the cell.,染色体的形成：,DNA+,组蛋白,=,核小体；,核小体绕成螺线管状,(,染色质丝,),；,染色质丝,+,非组蛋白,=,染色体；,1.1,染色体与基因,1.1,染色体与基因,17,世纪末,:,“,预成论,”,1865,年,:,孟德尔第一次提出了,“,遗传因子,”,1868,年，从外科绷带上的脓细胞的细胞核中分离得到一种含磷较高的酸性物质，称之为核素（,nuclein,）。核素实质是一种核糖核蛋白。,1.2,核酸的研究历史,瑞士科学家,F.Miescher,1889,年，,Altmann,首先制备了不含蛋白的核酸制品，并引入,“,核酸,”,这一名词。,20,世纪,20,年代测定了核酸的化学组成，并将核酸分为,DNA,和,RNA,。,1943,年，,E .Chargaff,的工作：嘌呤：嘧啶,=1,：,1,，由此推理出碱基配对的理论。,1944,年，,Avery,的肺炎双球菌转化实验，证明遗传物质即为,DNA,。,1953,年，,Watson-Crick,建立了,DNA,的双螺旋结构模型。,遗传密码的阐明、核酸内切酶的发现、核酸的合成与分析技术、基因重组技术等的建立形成了分子生物学的基本完整体系。,1.2,核酸的研究历史,核糖核酸,（,ribonucleic acid-,RNA,）,转移,RNA(transfer RNA-,tRNA,),信使,RNA(messenger RNA-,mRNA,),核糖体,RNA,（,ribosomal RNA-,rRNA,）,脱氧核糖核酸（,deoxyribonucleic acid-,DNA,）,DNA,功能：,遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。,RNA,功能：,参与遗传信息的表达。,2.,核酸的概念、分类,真核生物,原核生物,DNA,细胞核（,95%,）,线粒体、叶绿体（,5%,）,核质区（拟核）,RNA,细胞质（,75%,）,线粒体、叶绿体（,15%,）,细胞核（,10%,）,细胞质,2.,核酸的概念及分类,DNA,功能：,遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。,RNA,功能：,参与遗传信息的表达。,3.,核酸的生物学功能,第二章 核酸的结构,1,、基本单位：核苷酸,3,、,RNA,的结构,2,、,DNA,的结构,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,碱基,水,解,核蛋白,蛋白质,组成元素（,C,H,O,N,P,）,1.1,核酸的基本组成,核苷,核酸,核苷酸,碱基,许多个,戊糖,磷酸,1.1,核酸的基本组成,组成核酸的戊糖有两种,组成,DNA,组成,RNA,1.2,戊糖,核酸中的碱基分两类：,（,1,）,嘧啶碱,：胞嘧啶（,C,） 尿嘧啶（,U,）,胸腺嘧啶（,T,）,（,2,）,嘌呤碱,：腺嘌呤（,A,） 鸟嘌呤（,G,）,1.3,碱基,尿嘧啶,U,胸腺嘧啶,T,胞嘧啶,C,DNA,特有,RNA,特有,1.3.1,嘧啶碱基,鸟嘌呤,G,腺嘌呤,A,1.3.2,嘌呤碱基,核酸中的部分稀有碱基,DNA,RNA,嘌呤,7-,甲基鸟嘌呤,N,6,-,甲基腺嘌呤,N,6,-,甲基腺嘌呤,N,6,N,6,-,二甲基腺嘌呤,7-,甲基鸟嘌呤,嘧啶,5-,甲基胞嘧啶,5-,羟甲基胞嘧啶,假尿嘧啶,二氢尿嘧啶,1.3.3,稀有碱基,Some minor purine and pyrimidine bases,Minor bases found in DNA.,Some minor bases of tRNAs.,酮式烯醇式互变异构,氨基亚氨基互变异构,具有吸收紫外光的性质，最大吸收波长在,260 nm,左右,碱基的紫外吸收光谱随,pH,的改变而改变,化学性质比较稳定,嘌呤碱基还可以被银盐沉淀,1.3.4,碱基的性质,Keto-enol tautomeric shifts,内酰胺,内酰亚胺,This property is the consequence of the,aromaticity,of their heterocyclic ring structures.,核苷是一种糖苷，由戌糖和碱基缩合而成。,糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖的第一位上的碳原子（,C1,）与嘧啶碱的第一位上的氮原子（,N1,）或嘌呤碱的第九位上的氮原子（,N9,）相连，所以糖与碱基间的连键是,N-C,键，一般称之为,N-,糖苷键。,蛋白质与糖连接时，天冬酰氨的氨基与半缩醛羟基间形成的为,N-,糖苷键。,1.4.1,核苷的结构,糖与碱基之间以,C-N,糖苷键连接,1,1,1,9,1.4.1,核苷的结构,Nucleosides usually adopt an,anti conformation,about the glycosidic bond,核苷可用单字符号,A,（腺嘌呤核苷，简称腺苷）、,G,（鸟苷）、,C,（胞苷）、,U,（尿苷）表示。,脱氧核苷则在单字符号前面加一个小写的,d,，如,dA,（腺嘌呤脱氧核糖核苷，简称脱氧腺苷）、,dG,（脱氧鸟苷）、,dC,（脱氧胞苷）、,dT,（脱氧胸苷）。,稀有碱基（或称为修饰碱基）与戊糖通过糖苷键结合生成的核苷称为稀有核苷（或称为修饰核苷）。,1.4.2,核苷的表示,Nucleosides are more water soluble than free bases,Hydrophilicity of the sugar moiety,Nucleosides are stable in alkali.,Pyrimidine nucleosides are resistant to acid hydrolysis, purine nucleosides are easily hydrolyzed in acid.,1.4.3,核苷的性质,核苷中的戌糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸,作为,DNA,或,RNA,结构单元的核苷酸分别是,5-,磷酸,-,脱氧核糖核苷和,5-,磷酸,-,核糖核苷。,1.5.1,核苷酸的种类,磷酸,碱基,戊糖,1.5.1,核苷酸的种类,H,2,O,碱基,磷酸,戊糖,糖苷键,脂键,H,2,O,1.5.1,核苷酸的种类,1.5.2,核苷酸的结构与命名,M-,单,(D-,二；,T,三）；,P-,磷酸,RNA,的名称为某（单、二、三）磷酸核苷酸，,DNA,在某（单、二、三）前加脱氧两字。,如,AMP,称腺苷磷酸,(,或腺苷酸），,dAMP,称为脱氧腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）。,八种核苷酸的表示,1.5.2,核苷酸的结构与命名,1.5.3,多磷酸核苷及其衍生物,1.5.3,多磷酸核苷及其衍生物,参与核酸生物合成的直接原料不是一磷酸核苷酸，而是三磷酸核苷酸，如,ATP,（三磷酸腺苷酸）。,ATP,上的磷酸残基用,、,、,来编号。,ATP,含有两个高能磷酸酯键（,P,），其水解时释放出的能量为,7.3,千卡,/,克分子（普通磷酸酯键为,2,千卡,/,克分子）。,ATP,在细胞能量代谢中起着及其重要的作用。,1.5.3,多磷酸核苷及其衍生物,Nucleoside 5-triphosphates are,carriers of chemical energy,Potential of,phosphoryl group transfer,The bases of nucleotides serve as,Information Symbols,鸟苷四磷酸,鸟苷五磷酸,1.5.3,多磷酸核苷及其衍生物,1.5.4,环核苷酸,3,，,5-,环腺苷酸（,cAMP,）,3,，,5-,环鸟苷酸（,cGMP,）,碱基可以发生酮式和烯醇式的互变异构，体内以酮式为主。,核苷酸在,240,290 nm,具有强烈的光吸收，最大吸收波长在,260 nm,左右。,核苷酸是两性电解质，在不同的,pH,条件下，其解离程度不同，在某一,pH,值时，对外不表现出电性，该,pH,值称为其等电点。,核苷酸在日常生活中也有重要用途，如在食品行业中作为鲜味剂，称为呈味核苷酸。,1.5.5,核苷酸的性质,脱,H,2,O,脂键相连,3,，,5-,磷酸二酯键,首,尾,3,5,5,3,2.1,核酸的组成,2.1.1,碱水解,RNA,用,0.3 mol/L,的,NaOH,在,37,条件下处理,16,18 h,可被完全降解，得到,2,-,核苷酸和,3,-,核苷酸。,同样的条件下,DNA,十分稳定，不被降解。,利用此性质可以进行,DNA,和,RNA,的鉴别和分离。,RNA,水解产物中会含有,2,-,核苷酸？,2.1.2,酸水解,在不同的酸浓度下，核酸的水解产物不同。,嘌呤的糖苷键比嘧啶的糖苷键对酸更不稳定。,脱氧核糖的糖苷键比核糖的糖苷键更易被酸水解 。,2.1.3,酶水解,按照核酸酶作用底物,:,分为核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶,按照核酸酶对底物作用方式,:,分为核酸外切酶和核酸内切酶,按照核酸酶所作用化学键,:,分为磷酸二酯酶和磷酸单酯酶,蛇毒磷酸二脂酶,牛脾磷酸二脂酶,其中,B,代表嘌呤或嘧啶碱基,代表核糖或脱氧核糖,P,P,P,B,P,P,P,P,P,P,P,5,3,5,3,B,B,B,B,B,B,B,B,B,B,双链线性分子,:,细胞核内的,DNA,、有些动物病毒。,环状双链,DNA:,原核生物染色体,DNA,、质粒,DNA,、真核生物细胞器,DNA,、有些动物病毒。,各核苷酸残基沿多核苷酸链排列的顺序叫核酸的一级结构。,连接键：,3,，,5,一磷酸二酯键连接起来的直线形或环形分子。,DNA,没有侧链。,2.2 DNA,的一级结构,DNA,线条缩写,:,戊糖,5-,磷酸,P,A,核苷酸,5,3,首端,末端,P,P,P,P,P,P,A G C T G C,OH,3-OH,核苷酸顺序又称,碱基顺序,，是蛋白质与核酸结构的生物语言。,碱基,2.2 DNA,的一级结构,DNA,字母简写,:,5,A,P,G,P,C,P,T,P,G,P,C,P,3,或,5,A G C T G C,3,2.2 DNA,的一级结构,公认的为,1953,年,watson,和,crick,提出的,DNA,双螺旋结构模型。,2.2 DNA,的二级结构,2.2.1,实验证据,（,1,）,20,世纪,40,年代末，,Avery,证实了,遗传物质是,DNA,（,2,）,20,世纪,50,年代初，,Chargaff,规则：,无组织特异性；不随生物体的年龄、营养状态或环境变化而改变；,A=T,，,G=C,；不同生物来源的,DNA,碱基组成不同。,（,3,）,1952,年，,Wilkins,和,Franklin,等人研究,DNA,的,X,光衍射图谱，说明,DNA,分子可能含有,螺旋结构。,（,4,）,1952,年，,Gulland,和,Jordan,，说明,DNA,分子中的碱基间会形成,氢键。,（,5,）,1953,年，,Watson,和,Crick,，,DNA,双螺旋结构模型。,X-Ray Diffraction Study of DNA by Rosalind Franklin and Gosling,The discovery of the structure of DNA by Watson and Crick in,1953,was a momentous event in science, an event that gave rise to entirely new disciplines and influenced the course of many others. Our present understanding of the storage and utilization of a cells genetic information is based on work made possible by this discovery.,（,1,）,两条,多核苷酸链组成,反向平行,（,p5,-,糖,3,-p,的结构与,p3,-,糖,5,-p,的结构相对）,两条链的糖磷酸主链都是,右手螺旋,，有一共同螺旋轴,2.2.2 B-DNA,双螺旋结构模型的要点,（,2,）两条链上的碱基互补配对：,A-T,，,C-G,或,T-A,，,G-C,A,与,T,之间为二个氢键，,C,与,G,之间为三个氢键,2.2.2 B-DNA,双螺旋结构模型的要点,双螺旋的螺距为,3.4 nm,，螺旋的直径为,2 nm,，相邻碱基对平面间的距离是,0.34 nm,。,双螺旋的每一转有,10,对,核苷酸，相邻核苷酸之间的夹角为,36,。,（,3,）,2.2.2 B-DNA,双螺旋结构模型的要点,DNA Is a Double Helix,The Watson-Crick model for the structure of DNA,Watson-Crick structure is also referred to as,B-form DNA,大沟,小沟,2.2.2 B-DNA,双螺旋结构模型的要点,（,4,）,螺旋表面有一条大沟和一条小沟,（,5,）,碱基平面与双螺旋的中心轴垂直，糖环平面与中心轴平行,。,2.2.2 B-DNA,双螺旋结构模型的要点,（,6,）,双螺旋结构横向靠氢键稳定，纵向靠碱基堆积力维系稳定。,（,7,）一个链的碱基顺序确定后，则另一条链必有相对应的碱基顺序。碱基互补原则具有极重要意义，,DNA,复制、转录、反转录等过程的分子基础都是,碱基互补配对,。,（,1,）氢键：,两条链间碱基的相互作用，,A,与,T,之间为二条氢键，,C,与,G,之间为三条氢键。氢键作用力很弱，但,DNA,分子中存在大量氢键，因此氢键为一重要稳定因素；,（,2,）离子键及范德华力：,DNA,分子中磷酸基因在生理条件下解离，使,DNA,成为一种多阴离子，这有利于它与带正电荷的其它阳离子基团发生静电作用，这样减少双链间的静电排斥，有利于双螺旋的稳定；,（,3,）碱基堆积力：,目前普遍认为堆积碱基间的疏水作用是稳定,DNA,结构的更重要的因素。大量碱基层层堆积，两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的小分子隔开，有利于互补碱基之间氢键的形成；,2.2.3,双螺旋结构的稳定性,2.2.4 DNA,双螺旋的不同类型,B,型,DNA,（,B,DNA,）,:,在相对湿度为,92%,时，所得到的,DNA,钠盐纤维；,A,型,DNA,（,A,DNA,）,:,在相对温度低于,75%,时，获得的,DNA,钠盐纤维；,此外还有,Z,DNA,等；,2.2.4 DNA,双螺旋的不同类型,2.2.5,三螺旋,DNA,和四螺旋,DNA,双螺旋,DNA,可以与单链,DNA,分子结合形成三螺旋,DNA,；,人工合成的单链,DNA,序列（,T/A,）,mGn,（,m,1,4,，,n,1,8,）中的,4,个鸟嘌呤可以通过,Hoogsteen,氢键配对形成分子内或分子间的四螺旋,DNA,；,当研究某些小病毒、线粒体、叶绿体及某些细菌中分离出来降解的,DNA,时，发现它们的双螺旋二级结构还可进一步紧缩成闭链环状或开链环状以及麻花状等，这是,DNA,形成的三级结构。,松弛形,解链环形,负超螺旋,2.3 DNA,的三级结构,DNA,的超螺旋可分为：,正超螺旋,：两者的螺旋方向相反，螺旋结构更紧。,负超螺旋,：两者的螺旋方向相同，螺旋结构更松。,超螺旋,线状,松弛形,分子量标准,2.3 DNA,的三级结构,2.4,基因组,(DNA),基因组,是指生物体的单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部,DNA,分子或,RNA,分子的总和。,为了揭示生命奥秘，必须要测定生物体的基因组序列。,目前已经完成了病毒、大肠杆菌、酵母、果蝇、玉米、水稻和人类基因组的测序，得出人类基因组的大小为,3.2,10,9,bp,，用于编码蛋白质的基因序列约为,31 000,个，只占基因组的,1.1%1.4%,。,Genome Sequence and Its Annotation,Ancient Map,Detailed Map,Functional Map,Nucleosomes Are the Fundamental Organizational Units of Chromatin,Histones Are Small, Basic Proteins,The beads-on-a-string structure observed,with EM.,Nucleosomes Are Packed into Successively Higher-Order Structures,Nucleosomes Are Packed into Successively Higher-Order Structures,3.1 RNA,一级结构,RNA,的一级结构指的是多核苷酸链中,核糖核苷酸,的排列顺序，即多核苷酸链中,碱基,的排列顺序。,RNA,是无分支的,线形,结构。,含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、和尿嘧啶四种碱基，尚含有多种,“,稀有碱基,”,和特殊形式的核苷。,其中以各种甲基化的碱基和,“,假尿嘧啶核苷,”,尤为丰富。,假尿苷,这些不寻常的成分可能与,tRNA,的生物学功能有一定的关系。,3.1 RNA,一级结构,含量,:,占总,RNA,的,5%,。,存在：,在细胞核中以,DNA,为模板被合成以后，可能暂存于,核仁,内，也可能立即转移到,胞质,中，并以每分子,mRNA,与几个或几十个核蛋白体结合成串珠样的多核蛋白体形式而存在。,特点：,一般都很不稳定，代谢活跃，更新迅速，寿命较短，种类很多。,功能,:,在蛋白质生物合成中起传递遗传信息的作用，故也叫信息,RNA,（,iRNA,）。,3.2 RNA,一级结构,mRNA,真核,单顺反子,5,-末端有,“,帽子,”,3,-末端有,polyA,片段,原核,多顺反子,5,-末端无,“,帽子,”,3,-末端,无,polyA,片段,顺反子：,mRNA,上具有翻译功能的核苷酸顺序。,单顺反子：,只编码一个蛋白质的,mRNA,。,polyA,片段：,指,10,200,个多聚腺苷酸，这与,mRNA,顺利通过核膜进入胞浆有关，也与,mRNA,从细胞核转移到核糖体的过程有关，也有人认为与病毒侵染性有关。,“,帽子,”,结构：,5,-,末端的,G,被甲基化，通过焦磷酸与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以,5,、 5,-,磷酸二酯键相连,此结构对,mRNA,的翻译活性是重要的。,3.2 RNA,一级结构,mRNA,3.2 RNA,一级结构,mRNA,含量：,占细胞总,RNA,的,75-80%,。,存在：,与蛋白质结合成核蛋白的形式，存在于细胞质的核蛋白体中。,功能：,以核蛋白体的形式在蛋白质生物合成中提供合适的工作场所。,分子量,:,它的分子量都比较大，大肠杆菌核糖体中有三类,rRNA,（它们的沉降系数分别为,5S,、,16S,、,23S,）；动物细胞核糖体,rRNA,有四类（,5S,、,5.8S,、,18S,和,28S,）。,3.3 RNA,一级结构,rRNA,大肠杆菌,5SRNA,的结构,3.3 RNA,一级结构,rRNA,原核生物：,是由,30S,和,50S,两个亚基组成的,70S,的,rRNA,和蛋白质聚合体，其中,rRNA,含,66,。,真核生物：,是由,60S,和,40S,两个亚基组成的,80S,的,rRNA,和蛋白质聚合体，其中,rRNA,含,60,。,3.3 RNA,一级结构,rRNA,含量：,约占细胞总,RNA,的,10,15%,。,存在：,tRNA,溶于,“,胞液,”,部分中，它们以自由状态或以氨基酸结合状态而存在。,分子量：,由,60,95,个核苷酸残基组成，都较小,功能：,蛋白质的生物合成中起选择性运输原料（氨基酸）的作用，因此把,tRNA,叫受体,RNA,。每种氨基酸都有对应的一种或几种,tRNA,。,3.4 RNA,一级结构,tRNA,tRNA,的三叶草型结构特点（总）,反,密码环,氨基酸接受区（氨基酸臂）,二氢尿嘧啶区,反密码区,TC,区,额外环（可变区）,氨基酸臂,二氢尿嘧啶区,额外环,TC,区,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,tRNA,一般由四臂四环组成。分子由,A-U,、,G-C,碱基对构成的双螺旋区叫做臂；不能配对部分叫环。,叶子,臂,1,2,3,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,（,1,）三叶草的叶柄叫做氨基酸臂，它包括,3,，,端接受氨基酸的部位,CpCpAOH,。,载运氨基酸,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,（,2,）左臂连接一个二氢尿嘧啶环（,D,环），环上含有二氢尿嘧啶。,D,环,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,（,3,）位于氨基酸臂对面的反密码环含有组成该,tRNA,反密码子的三个核苷酸。,反密码子环,反密码子,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,（,4,）右侧有一个,T,C,环（含有,T,C,顺序，,代表假尿苷）和一个可变环，不同,tRNA,的可变环上核苷酸的数目变化较大。,T,C,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,额外环,额外环（可变区）位于反密码区和,TC,区之间，该区的核苷酸长度变化较大，可作为,tRNA,分类的标准。,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,tRNA,分子中含有修饰碱基，但多少不等。在某些位置上的核苷酸对于所有的,tRNA,都是同样的，或变化很少叫做不变核苷酸。,稀有碱基,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,tRNA,的三级结构,:,倒写的,L,字母,氨基酸的接受端,3,，,-,端,-CCA,反密码子,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,3.5 RNA,的高级结构,tRNA,第三章 核酸研究技术,1,、核酸性质,3,、核酸研究方法,2,、核酸分离分析,1,相对分子质量,2,粘度与沉降特性,3,紫外吸收,4,变性与复性,5,熔解温度,6,克原子磷消光系数,1.,核酸的理化性质,纯品,DNA,为白色纤维状固体，,RNA,为白色粉末。,DNA,、,RNA,及核苷酸为极性化合物，溶于水，不溶于有机溶剂。,DNA,能被乙醇和异戊醇沉淀。,1.1,核酸的物理特性,1.2,核酸的两性解离,DNA,和,RNA,都为两性电解质，具有等电点。,核酸在,pH4,时，带负电荷,等电点（,pI,）：,pI,pKa1,pKa2,2,DNA,的相对分子质量较大，一般为,10,6,10,9,bp,，大多数,DNA,为线性分子，分子极不对称，虽然其长度可达,cm,级但分子的直径只有,nm,级。,RNA,的相对分子质量较小，通常为,10,4,10,6,bp,。,1.3,相对分子质量,DNA,能被乙醇和异戊醇沉淀。,DNA,分子的粘度比,RNA,分子的粘度要大得多 。,不同相对分子质量的核酸沉降速度不同。一般情况下，,RNADNA,，超螺旋,DNA ,环状,DNA ,线形,DNA,。,1.4,粘度与沉降特性,嘌呤碱与嘧啶碱有共轭双键，使碱基核苷、核苷酸和核酸在,240,290nm,紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在,260nm,附近。,1.5,紫外吸收,1.6,变性与复性（变性）,定义：,指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，它并不涉及共价键（磷酸二酯键）的断裂。,变性因素：,热变性、酸碱变性和化学变性等。,1.6,变性与复性（变性）,定义：,变性,DNA,在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构。,高温变性,缓慢冷却,热复性,退火,1.6,变性与复性（复性）,DNA,复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得到部分恢复。但将热变性的,DNA,骤然冷却，不能复性，只有缓慢冷却时才可以复性。,高温变性,缓慢冷却,热复性,急速冷却,复性失败,1.6,变性与复性（复性）,影响核酸复性速度的因素很多：,核酸浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。,核酸分子越大，链间错配频率越高，复性速度越慢。,核酸链内重复序列多，易形成互补配对，复性速度较快。,维持一定的溶液离子强度，消弱磷酸基静电斥力，可加快复性速度。,选择最佳的复性温度，温度太高会使核酸发生变性，而温度过低会使错配的两链无法分开。,1.6,变性,与复性,（复性）,通常把,DNA,的双螺旋结构失去一半时的温度称该,DNA,的溶点或溶解温度，用,Tm,表示，,DNA,的,Tm,值一般在,70,85,0,C,之间。,变性的相对量,温度,0,C,60,80,100,1.0,1.2,1.4,1.6,0,Tm,Tm,Tm,100%,Poly d(A-T),Poly d(G-C),DNA,1.7,熔解温度,Tm,值的大小与下列因素有关：,（,1,）,DNA,的均一性,（,2,）,G-C,含量,（,3,）介质中的离子强度,1.7,熔解温度,（,1,）,DNA,的均一性：,一般均一性越高，,Tm,值的变动范围越小。,（,2,）,G-C,含量：,G-C,含量越高，,Tm,值越大，,Tm,与,G-C,含量成正比关系。因为,G-C,比,A-T,更稳定（氢键）。,Tm,与所含,G-C,的多少的关系，可用经验公式计算不同,DNA,的,Tm,：,（,G,C,）,(Tm,69.3),2.44,1.7,熔解温度,Tm,与所含,G-C,的多少有关,1.7,熔解温度,（,3,）介质中的离子强度：,一般离子强度较低，,DNA,的,Tm,值也较低，范围也越窄。,温度,0,C,70,80,100,1.2,1.4,1.5,90,1.1,1.3,A,260,0.01,0.02,0.05,0.2,0.1,0.5,1.0,大肠杆菌,DNA,在不同,KCl,浓度下的,Tm,1.7,熔解温度,1.8,克原子磷消光系数,核酸分子中磷原子的含量基本稳定。,根据磷的含量测定核酸溶液的光密度，以每升核酸溶液中一克原子磷为标准来计算核酸的消光系数，就叫做,克原子磷消光系数,，用,（,P,）,表示。,2.1,核酸的分离,目前最常用的为酚提取法：,即用缓冲液,饱和的酚溶液,直接处理组织或细胞，以除去其中的蛋白质和,DNA,。,若加入适量,十二烷基硫酸钠或其它去污剂,可进一步抑制核糖核酸酶，并使蛋白质去除得更加干净。,将得到的,RNA,提取液用,乙醇,反复沉淀数次，溶解后进行透析，再冷冻干燥。,提取不同种类的,RNA,时，也可将各种亚细胞部分事先分开（因为不同种类的,RNA,存在于细胞中的不同部位），然后分别从核蛋白体中提取,rRNA,，从多核蛋白体中提取,mRNA,，从去除这些成分及其它颗粒后的细胞液中提取,tRNA,。,2.1,核酸的分离,离心管中放,30%,5%,的蔗糖溶液。,欲分离,RNA,溶液放在蔗糖溶液面上。,经高速离心数小时后，分子大小不同的,RNA,即分散于不同密度的蔗糖部位中。,应用啡啶溴红氯化铯密度梯度平衡超离心，可分开不同构象的,DNA,、,RNA,和蛋白质。,2.2,密度梯度离心法,5,蔗糖,10,蔗糖,20,蔗糖,30,蔗糖,石蜡油,蛋白质,开环形及线性,DNA,闭环形质粒,DNA,RNA,用垂直转头,65000,转,6h,，角转头,45000,转,36h,。,离心后，蛋白质在最上面，,RNA,沉淀在底部，超螺旋,DNA,沉淀较快，开链或环形,DNA,沉淀较慢。,此法分离的,DNA,纯度较高，可供,DNA,重组等实验用。如需更纯品，可再进行一次氯化铯密度梯度离心。,2.2,密度梯度离心法,2.3,柱层析法,常用的支持体为二乙胺乙基（,DEAE,）纤维素（离子交换），葡聚糖凝胶等（凝胶过滤）。,因为核酸和核苷酸是两性电解质，在一定的,pH,值条件下各解离基团的解离情况不同，即有与蛋白质相似的等电点。,2.4,凝胶电泳法,不同种类的核酸分子所带电荷与其质量之比都非常接近，故用一般电泳方法不易分开。,若以某些凝胶为支持体进行电泳，由于凝胶的分子筛作用可影响不同核酸分子的泳动速度，则可得到较好的分离效果 。,琼脂糖凝胶电泳图,0.14mol,法（,DNA,的提取）,:,处理方法,结果,浓,NaCl,溶液（,1-2M,）,提取组织中的核蛋白,稀释至,0. 14mol,后,DNA,核蛋白的沉出,RNA,核蛋白则不沉出,浓,NaCl,溶解,DNA,核蛋白,氯仿或酚,除去其中的蛋白质,乙醇沉淀,提取溶液中的,DNA,蔗糖密度梯度离心法,分开各种,DNA,CSCl,或,Cs,2,SO,2,浓溶液的密度梯度离心法,分开单股和双股,DNA,2.5,核酸的分离小结,2.6.1,紫外法分析核酸,纯,DNA,的,OD 260/2801.8,。,纯,RNA OD 260/2802.0,，如果样品中含有杂蛋白，比值会明显下降。,如果,OD 260/2301.8,时样品是纯的，否则样品中含有杂多糖。通常,1.0OD,相当于,50g/mL,的双螺旋,DNA,或,40 g/mL,单链,DNA,（或,RNA,）或,20 g/mL,寡核苷酸 。,1965,年,Robert Holley,首先用测蛋白质氨基酸的序列方法（重叠法）测定了酵母丙氨酸,tRNA,的序列。,1977,年两位学者提出了,化学裂解法,和,双脱氧酶法,。这两种方法的基本原理相同，都是用不同的专一性手段使被分析的,DNA,分子断裂成若干带放射性标记的、长短不一的片段，然后用测,DNA,片段的相对长度来测核苷酸的顺序。即利用凝胶电泳使各种片段分离，再用放射自显影法显影。从放射自显影图谱读出被测核苷酸的序列。,2.6.2,核酸测序,化学法测定,DNA,序列时的,G,反应,32,P,32,P,32,P,32,P,用硫酸二甲脂修饰碱基,加热使修饰后的碱基脱落,T A,C G,T A,G C,T A,C G,T A,G C,T A,C,T A,G C,T A,C,T A,G C,CH,3,用碱切断,DNA,骨架,标记切断,*,GATCGGACCT,*GATCGGACC,*GATCGGAC,*GATCGGA,*GATCGG,*GATCG,*GATC,*GAT,*GA,*G,G,G+A,T+C,C,G,反应,G+A,反应,T+C,反应,C,反应,pGpApTpCpGpGpApCpCpT,化学法测定,DNA,序列时的,G,反应,双脱氧酶法测定,DNA,顺序,待测序列,A T T A G A C G T C C G T G C A A T G C,3,，,5,，,引物及固定端,加引物,A C G T T A C G,3,，,5,，,A T T A G A C G T C C G T G C A A T G C,A C G T T A C G,3,，,5,，,3,，,5,，,以,2,，、,3,，双脱氧三磷酸（,2,，、,3,，,d dNTP),来中止,DNA,的复制反应,加,32PdATP,，,dTTP,，,dGTP,，,dCTP,分成四份进行反应,加,ddATP/klenow,片断,加,ddTTP /klenow,片断,加,ddGTP /klenow,片断,加,ddCTP /klenow,片断,ACGTTACG,3,，,ddAGGC,ddATCTGCAGGC,ddAATCTGCAGGC,5,，,5,，,5,，,3,，,3,，,3,，,ddTGCAGGC,ddTCTGCAGGC,ddTAATCTGCAGGC,5,，,5,，,5,，,3,，,3,，,3,，,ddGC,ddGGC,ddGCAGGC,5,，,5,，,5,，,3,，,3,，,3,，,ddC,ddCAGGC,ddCTGCAGGC,5,，,5,，,5,，,3,，,3,，,加在序列胶之,A,行,加在序列胶之,T,行,加在序列胶之,G,行,加在序列胶之,C,行,双脱氧酶法测定,DNA,顺序,3.1,核酸研究的主要工具酶,1,核糖核酸酶类（,RNA,酶类）,2,脱氧核糖核酸酶类（,DNA,酶）,3,非专一性核酸酶类,专一作用于,RNA,，而不作用于,DNA,。,其分子量,14,000,，最适,pH7.0,8.2,，十分耐热。,具有高度的专一性，作用点为嘧啶核苷,3,磷酸与其他核苷酸之间的连键，生成,3,嘧啶核苷或以,3,嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。,P,P,P,P,P,P,C(U) B G A(G) B C,OH,RNaseI,RNaseI,3.1.1,牛胰,RNA,酶（,RNaseA,或,RNaseI,）,比,RNaseI,更具有专一性。,作用点为鸟嘌呤核苷,3,磷酸与其他核苷酸之间的连键，产物为,3,，鸟苷酸或以其结尾的寡核苷酸。,其分子量较小，耐酸耐热。,P,P,P,P,P,P,C(U) B G A(G) B C,OH,RNaseI,RNaseI,RNaseT1,3.1.2 RNA,酶,T1,（,RNaseT1,）,（,1,）牛胰脱氧核糖核酸酶（,DNaseI,）,：,此酶无碱基专一性，它切断双链,DNA,或单链,DNA,成为以,5,，,磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度为四个核苷酸，需,Mg,2+,，最适,pH7,8,。,（,2,）牛脾脱氧核糖核酸酶（,DNaseII,）,：,也无碱基专一性，降解,DNA,成为以,3,，,磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均长度为六个核苷酸，最适,pH45,，需,0.3mol/L,的,Na,+,激活。,Mg,2+,可以抑制此酶的活性。,3.1.3,脱氧核糖核酸酶类（,DNA,酶,1,）,是,1971,年，,Arber,、,Smith,和,Nathams,等人在细菌体内发现的一类对,DNA,具有极高碱基专一性的内切酶。,是,DNA,顺序测定，基因分离和基因体外重组等研究中十分重要的工具酶。,这类酶主要降解外源的未经特殊修饰的,DNA,，但不降解自身细胞的,DNA,。,一般识别顺序包含,4,6,个碱基对。,（,3,）限制性内切酶,(,限制酶,),3.1.3,脱氧核糖核酸酶类（,DNA,酶,1,）,大多数限制性内切酶的识别顺序具有回文结构（反向重复序列）,T T A G C A C G T G C T A A,A A T C G T G C A C G A T T,反向重复,5,，,3,，,3,，,5,，,（,3,）限制性内切酶,(,限制酶,),3.1.3,脱氧核糖核酸酶类（,DNA,酶,1,）,大多数酶切割后形成粘末端,G A A T T C,C T T A A G,EcoRI,G A A T T C,C T T A A G,3,，,5,，,+,粘性末端,粘性末端,5,，,5,，,5,，,3,，,3,，,3,，,（,3,）限制性内切酶,(,限制酶,),3.1.3,脱氧核糖核酸酶类（,DNA,酶,1,）,少数酶切割后形成平整末端,G T Py Pu A C,C A Pu Py T G,3,，,HindII,平整末端,G T Py Pu A C,C A Pu Py T G,+,5,，,5,，,5,，,5,，,3,，,3,，,3,，,（,3,）限制性内切酶,(,限制酶,),3.1.3,脱氧核糖核酸酶类（,DNA,酶,1,）,对,RNA,、,DNA,都有作用，是从核苷酸链的,3,羟基端开始，逐个切开,5, 核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键，得到,5,核苷酸。,（,1,）蛇毒磷酸二酯酶,P,P,P,H,2,O,OH,P,P,P,OH,OH,+,3.1.4,非专一性核酸酶类,可作用,RNA,和,DNA,，是从,5,-,羟基端开始，逐个切开,3,-,核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键，得,3,-,核苷酸。,P,P,P,H,2,O,OH,+,（,2,）牛脾磷酸二酯酶,P,P,OH,P,P,P,OH,3.1.4,非专一性核酸酶类,概念：,两种来源不同，具有互补碱基序列的多核苷酸片段在溶液中冷却时，可以再形成双螺旋结构，称为杂交作用。,DNA,和,DNA,杂交以及,DNA,和,RNA,杂交在核酸技术中占有十分重要的地位。,3.1,分子杂交,原理,:,核酸（,DNA,）的变性和复性的性质，也就是在带有互补顺序的同源单链间的配对过程中，,DNA,单链可重新形成双链，,DNA,单链也可与,RNA,互补成为杂交分子。因此有,DNA,类、,DNA-RNA,类两种杂交。如把已知序列的分子预先用放射性同位素（,32,P,）标记（称为探针，,Probe,），即可用其识别或,“,钓出,”,另一分子中的同源部分。,意义：,核酸杂交可以在液相或固相上进行，是基因工程和分子生物学的重要技术之一。是鉴定阳性重组体、筛选基因、确定,DNA,的同源性、研究基因定位、组建,DNA,的物理图谱、研究,DNA,的间隔顺序等的有效手段。,3.1,分子杂交,种类：,1975,年英国分子生物学家,E.M.Southern,首先发明的一种杂交,“,印迹法,”,Southern,印迹法,（,Southern bloting,：,DNA-DNA,）。,1977,年,G.R Stark,建立了测定,RNA,的分子杂交技术。,Northern,印迹法,（,Northern bloting,：,DNA-RNA,）。,用类似的方法，根据抗体与抗原可以结合的原理，开发了分析蛋白质的方法,Western,印迹法,（,Western bloting,：抗原,-,抗体）。,3.2,分子杂交技术类别,1,将,DNA,样品经限制性内切酶降解后，用琼酯糖凝胶电泳进行分离。,2,将胶浸泡在碱（,NaOH,）中使,DNA,变性。,3,将变性,DNA,转移到硝酸纤维膜上（膜只吸附变性的,DNA,）。,4,80,0,C,烤,4,6h,，使,DNA,牢固地吸附在膜上。,3.3 DNA,DNA,杂交实验法,5,与放射性同位素标记的、变性后的,DNA,探针进行杂交，此过程需要在较高的盐浓度及适当的温度（一般,680C,）下进行了几十几个小时。,6,洗涤除去杂交标记物。,7,将膜烘干后进行放射自显影。,3.3 DNA,DNA,杂交实验法,DAN,分子,限制片断,带有,DAN,片断的凝胶,限制性酶切割,琼脂糖凝胶电泳,3.3 DNA,DNA,杂交实验法,吸附,DAN,片断的膜,转移至硝酸纤维素膜上,带有,DAN,片断的凝胶,放射性显影,与放射性,DNA,探针杂交,凝胶,滤膜,3.3 DNA,DNA,杂交实验法,