补体的测定及应用

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,补体的测定及临床应用,1,补体是一组存在于人和脊椎动物血清中具有酶样活性、不耐热的糖蛋白,补体不是单一成分，在功能效应上是以连续反应的程序进行的，故又称补体系统,补体系统由补体固有成分、补体调节蛋白和补体受体组成,补体的存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人血清中，含量相对稳定，但某些疾病时，含量及其活性可发生改变,补体含量与活性的检测，对机体免疫状态的评价和疾病的诊断具有重大意义,2,补体的含量,补体大多为糖蛋白，属于,球蛋白,正常血清中补体各组分含量相差较大，其中,C3,含量最高。,补体主要在血液和肝脏中进行代谢，代谢率快，每天更新一半,3,补体的理化特性,补体性质不稳定，容易受各种理化因素的影响,补体标本保存在-20,4,补体的活化途径,1,、经典途径,以抗原抗体复合物结合,C1q,启动激活的途径，又称第一途径或传统途径，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式,2,、,MBL,途径,MBL,结合至细菌启动的途径，激活剂是机体的炎症反应急性期时产生的,MBL,和,C,反应蛋白等,3,、旁路途径,通过微生物表面等膜性物质，从,C3,开始，不依赖特异性抗体的形成，在感染早期可为机体提供有效的防御。,在机体感染的过程，首先活化和发挥作用的是旁路途径和,MBL,途径，在特异性抗体产生时，经典途径才可发挥作用,5,三 种 途 径 比 较,6,补体总活性测定,补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称CH50.CH50通常是指CP-CH50（经典途径）,7,CH50的测定方法,原理,应用绵羊红细胞（,SRBC,）和其相应的抗体（溶血素），作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相关（特殊的,S,性关系）。将新鲜待检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以,50%,溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总溶血活性,8,CH50测定方法,1,、红细胞浓度的调整,绵羊红细胞（,SRBC,）采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏（,Alsever,）血液保存液制成抗凝血，,4,保存备用。使用前，调制成,2%,5% SRBC,悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，加入,20,30,倍的稀释液，在,542nm,波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。,9,2,、溶血素滴定,溶血素可通过,SRBC,免疫家兔获得，一般无需纯化,试验前需先行加热,56 30min,或,60 3min,以灭活补体,溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用,自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性测定中，大多使用,2,个单位。,溶血素效价稳定，一般使用,3,个月后再作重新滴定,10,3,、稀释缓冲液,磷酸缓冲液等,PH7.2-7.4,加入适量,NACL,保存等渗,Ca,2+,、,Mg,2+,11,50%溶血标准管,12,CH50的计算,CH50(U/ml)=1/血清用量稀释倍数,不同的CH50测定方法，其活性参考范围不一样，一般以反应总体积2.5ml为常用，参考范围50-100U/ml.,13,方法学评价和临床意义,方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比外，还与反应所用的缓冲液、,SRBC,的数量以及反应温度有关,总补体活性的参考范围为,50,100U/ml,CH50,增高见于：,急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等,CH50,降低见于：,系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球肾炎等,14,单个补体成分的测定,常作为单个补体成分的检测指标：,C3,、,C4,、,C1q,、,B,因子和,C1,酯酶抑制物等,测定方法：,免疫溶血法（检测单个补体成分的活性）,化学法（检测单个补体成分的含量）,自动化免疫散射比浊法,15,免疫溶血试验,试验依据：抗原抗体结合后可激活补体的经典途径，可导致细胞溶解,指示系统,:,以,SRBC-,抗,SRBC,为激活物和指示系统,参照体系,:,以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照,参照血清常称之“,R,（,remove,）”试剂，即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人,C2,缺乏、豚鼠,C4,缺乏、小鼠,C5,缺乏和家兔,C6,缺乏的血清,结果判度,:,若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分活性呈正比，仍以,50,溶血为终点,免疫溶血法常用于,C2,、,C3,、,C4,、,C5,、,C6,等补体成分的检测。其中以,C3,、,C4,两成分的检测更为常见,16,免疫化学法,免疫化学法分类,1.,单向免疫扩散,2.,火箭免疫电泳,3.,透射比浊法,4.,散射比浊法,前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰。后两种方法：通过仪器对补体的,C3,、,C4,、,B,因子等单个成分进行自动化测定,17,补体结合试验,补体结合试验,(complement fixation test,，,CFT ),将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应 系统中抗原或抗体的传统方法。是利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定。,18,试验有,5,种成分参与，分属,3,个系统,1,、反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）,2,、补体系统,3,、指示系统：,SRBC,与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（,SRBC,S,）。,反应分两步进行,第一步,:,反应系统与补体的作用,第二步,:,指示系统利用剩余补体的反应,不溶血为补体结合试验阳性，反应系统含待测抗原（或抗体）；而溶血为试验阴性，说明反应系统不含待测抗原（抗体）,19,试剂准备,抗原或抗体,1,、用于试验的抗原或抗体,:,需要纯化；纯度愈高，特异性愈强,2,、抗原与抗体比例适当,:,确定抗原或抗体相应的使用单位；,采用方阵或棋盘法进行抗原与抗体滴定,20,补体,1,、多采用豚鼠血清为补体,2,、补体的量为恒量,3,、对补体进行滴定和确定其用量，以能产生完全溶血的最少补体用量为,1,个实用单位，正式试验时使用,2,个实用单位。,4,、补体的性质不稳定，试验前均应进行滴定,21,待测标本,1,、采血并及时分离血清用于检测或,20,保存备用。,2,、试验前，应先将血清,56,加热,30min,（或,603min,）以灭活补体。,血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理：,加热灭活时提高,12,20,冻融后离心去沉淀,以,3mmol/L,盐酸处理,加入少量补体后再行灭活,以白陶土处理,通入,CO2,以小白鼠肝粉处理,用含,10,新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清,22,正式试验,分类,:,小量法、微量法，以小量法常用,实验过程,:,稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、补体温育,与指示系统共育,结果判度,:,对照管,:,阴性对照管,:,溶血,阳性对照管,:,不溶血,抗体或抗原对照管,:,完全溶血,待检血清对照管,:,完全溶血,绵羊红细胞对照管,:,不出现自发性溶血,23,补体对照管：,受检血清,阳性,:,不溶血,阴性,:,溶血,注意,:,若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。,2,个单位,:,全溶,1,个单位,:,全溶或略带少许红细胞,0.5,个单位,:,不发生溶血,24,三,、方法评价,优 点,灵敏度高、所测定的抗体水平可达,0.05g/ml,，,出现交叉反应的机率较小，,可检测的抗原或抗体范围广泛，,无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高,现 状,影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，,现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃,补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用,25,补体测定的应用,补体相关试验：,诊断梅毒螺旋体感染的华氏反应（已淘汰）,HLA,分型的补体依赖性细胞毒试验,抗原抗体检测的脂质体免疫试验、免疫粘连血凝试验,抗体形成细胞定量检测的溶血空白斑技术,免疫复合物测定的胶固素结合试验和,C1q,结合试验,26,应用于补体含量和活性检测的试验,AP-CH50,和,AP-H50,试验,:,反映总补体活性,溶血试验,免疫化学试验,免疫荧光技术,检测补体单个成分及其裂解产物（,C1q,、,C3SP,、,C3,、,C4,、,B,因子等）和补体受体,27,(,图,),血管神经性水肿,补体含量和活性相关的疾病,1,免疫相关性疾病：,如自身免疫性疾病时，,C1,、,C2,、,C3,、,C4,和,Hf,等缺陷；,超敏反应时（,III,型超敏反应），,C3a,、,C5a,等过敏毒素的产生。,2,与补体有关的遗传性疾病：,C2,、,C3,缺陷导致的严重感染；,与,C1,抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿,SLE,患者出现的细胞表面,CR1,缺陷与,C1C,清除障碍,涉及,I,因子、,H,因子缺陷的肾小球肾炎；,DAF,缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；,C1q,缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及,C1q,、,C1r,、,C4,、,C2,缺陷造成的,免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。,(,图,),血管神经性水肿,28,3,补体含量显著降低的疾病,：,消耗增多,:,免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多,.,如,SLE.,补体的大量丢失,:,主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者,补体合成不足,:,常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。,4,高补体血症：,偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。,29,