荧光性假单胞菌抗性基因的筛选课件

你的标题,请在此键入你的内容,一级标题,二级标题,三级标题,四级标题,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光性假单胞菌,抗性基因的筛选,实验背景,荧光假单胞菌可产生,10,多种具有抗菌作用的,抗生性次级代谢产物,藤黄绿脓菌素,【Plt】,硝吡咯菌素,【Prn】,2,，,4-,二乙酰基藤黄酚,【Phl】,生物表面活性剂（环脂肽,【CLP】,、鼠李糖脂）,嗜铁素,(,水杨酸、绿脓杆菌螯铁蛋白、青脓素,),卵菌素,A,氢氰酸,邻氨基苯甲酸,随着生物工程技术的发展，从分子水平对藤黄绿脓菌素,(Plt),、,2,，,4-,二乙酰基藤黄酚,(Phl),、硝吡咯菌素,(Prn),、环脂肽,(CLP),等抗生性次级代谢产物的合成机制进行了深入研究，与其相关的功能基因已经被鉴定。,本实验设计了针对特定基因的引物，利用,PCR,技术，筛选可以产生藤黄绿脓菌素,(Plt),、,2,，,4-,二乙酰基藤黄酚,(Phl),、硝吡咯菌素,(Prn),、环脂肽,(CLP),的荧光性假单胞菌,实验流程,一，实验准备,1,，配置,LB,培养基，灭菌,2,，,96,孔板清洗干净，包好 灭菌,3,，移液器枪头（,1mL,，,200uL,，,10uL,），,0.2mL PCR,管，,1.5ml EP,管，包好灭菌,4,，去离子水，灭菌,二，荧光性假单胞菌菌种的活化,1,，在,96,孔板的每个孔中加入,540l LB,培养基,2,，接入,60l,甘油菌,注意：这一步要做好记录，记清楚每个孔中接入,的是那一株菌种,注意：每一组学生接种一支阳性菌株,Pf-5,3,，将接过菌的,96,孔板置于,28,摇床过夜培养,注意：,96,孔板需固定好，防止倾斜导致菌种,交叉污染,接种记录表格,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,A,Pf-5,B,C,D,E,F,G,H,三，菌落,PCR,所用引物,a.,环脂肽,CLP: (1) PGPRB-4965/PGPRB-4966,(2) PGPRB-5045/PGPRB-5046,b. 2,4-,乙酰藤黄酚,Phl: Phl2a/Phl2b,c.,硝吡咯菌素,Prn: Prnd1/Prnd2,d.,藤黄绿脓菌素,Plt: PltC,1,/PltC,2,三，菌落,PCR,PCR,体系,: 20ul,灭菌去离子水,15.2 ul,10,buffer 2 ul,dNTP 0.8 ul,上游引物,0.4 ul,下游引物,0.4 ul,Taq,酶,0.2 ul,模板,1 ul,以,8,个样品、,1,个阳性对照（,Pf-5,）和,1,个阴性对照为例的,MIX,10,PCR H2O 15.2ul 152ul,10buffer 2ul 20ul,dNTP 0.8ul 8ul,上游引物,0.4ul 4ul,下游引物,0.4ul 4ul,Taq,酶,0.2ul 2ul,在,EP,管中加入试剂后，分装入,10,个,PCR,管中，,19ul/,管，其中,1,管作为阴性对照，,1,管作为阳性对照，加入,1uL,Pf-5,菌液作为模版，剩下,8,管分别加入,1ul,模板,菌落,PCR,实验流程,根据各组所做的模板数目计算,mix,，依次加入除模板之外的各试剂后混匀，离心，分装,19 uL,入,PCR,管，对,PCR,管进行编号,将活化好的菌液取,100 uL,按照编号从,96,孔板分别移到,1.5mL EP,管中，盖紧盖子，置于沸水中煮,10,分钟。离心，各取,1 uL,作为模板加入,PCR,管中,将,PCR,管放入设好程序的,PCR,仪中运行,四，琼脂糖凝胶电泳检测,PCR,结果,1,，配置,1%,的琼脂糖凝胶,称取,0.8 g,琼脂糖，加入,80mL 1xTAE,缓冲液，置于电炉上煮沸,3,次，冷却至不烫手时加入,40 uL,的,EB,染料，摇匀，倒入胶板。放置梳子（,注意选择足够孔数的梳子,）。静置,30-40 min,待凝胶冷却。,2,，点样，电泳,将凝胶移入电泳槽，电泳槽中应该有充足的,1x TAE,缓冲液。,PCR,产物中加入,2 uL 10x,上样缓冲液，混匀，离心。每孔依次点样,4,uL,，,记录每孔点入的样品编号,。每一块凝胶的一个孔需加入,4,uL Pf-5 PCR,产物作为对照。,120V,电泳,30,min,3,，结果,凝胶成像记录电泳结果,1 2 1 2 1 2 M,prn,phl,plt,Prn,：,786 bp,Phl,：,745,bp,Plt,：,438,bp,。,CLP,PGPRB-4965/PGPRB-4966 360,bp,PGPRB-5045/PGPRB-5046 960,bp,五，整理实验结果并进行菌种的保藏,记录并整理,PCR,结果阳性的编号,相应编号的菌株需进行保藏,撰写实验报告，附实验结果记录表格,（每个小组撰写一份报告）,序号,菌种编号,4965/4966,5045/5046,phl,prn,plt,1,XXX,+,+,2,XXX,+,实验结果记录表格,