《动物传染病学（实验）》课件6 伪狂犬病抗体检测

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验六、伪狂犬病抗体检测,（,阻断,ELISA),酶联免疫吸附试验,(,Enzyme-Linked,ImmunoSorbent,Assay, ELISA),将已知的抗原或抗体吸附在固相载体,(,聚苯乙烯微量反应板,),表面，从而使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。,一、实验目的,掌握,ELISA,的原理和类型。,掌握阻断,ELISA,操作程序和结果判定的方法。,二、实验原理,抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；,抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；,酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。,间接法（,Indirect ELISA,）,阻断法（,Block ELISA),双抗体夹心法（,Sandwich ELISA),竞争法（,Competitive ELISA),（,1,）间接法测定抗体,A.,将,抗原,吸附于固相载体表面；,B.,加抗体,形成抗原,-,抗体复合物,;,C.,加酶标抗体；,D.,加底物。测定底物的降解量抗体量。,显色,间接,ELISA,（,2,）阻断法测定抗体,A.,将,抗原,吸附在固相载体表面,;,B.,先加待检血清（抗体）,形成抗原,-,抗体复合物,;,C.,再加酶标单抗,(,二抗,),；,D.,加底物。,酶标单抗,血清,？,底物显色,阻断,ELISA,（,3,）双抗体夹心法测定抗原,A.,将,抗体,吸附于固相表面,;,B.,加待检抗原，形成抗原,-,抗体复合物,;,C.,加酶标抗体,;,E.,加底物。底物的降解量抗原量。,（,4,）竞争法测定抗原,A.,抗体,吸附在固相载体表面,;,B.,同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原；,C.,加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,酶标板，酶标仪,包被缓冲液：,0.025M pH9.6,碳酸盐缓冲液,猪伪狂犬病毒（,PRV,）,抗原,样品稀释液：,pH7.4 PBS,三、实验材料,阴性对照（,EP,管中，已稀释）,阳性对照（,EP,管中，已稀释）,样品,待测猪血清（,EP,管中，已稀释）,碱性磷酸酶标记猪,PRV,单抗,酶标单抗（,EP,管中，已稀释）,洗涤液：含,0.05%,Tween,20,的,0.01M pH7.4 PBS,（青瓶）,常用酶及底物,常用酶,底物,反应后颜色,辣根过氧化物酶（,HRP,）,邻苯二胺（,OPD,）,棕黄色,碱性磷酸酶,（,AP,）,四甲基联苯胺,（,TMB,）,蓝色,底物缓冲液：,pH5.0,磷酸盐柠檬酸缓冲液,底物溶液：,TMB,（四甲基联苯胺），底物缓冲液，,30% H,2,O,2,，,新鲜配制,终止液,1.,抗原处理：,2.,抗原包被：,取酶标板，加入,100L/,孔的抗原稀释液,4,，,18h,取出包被好抗原的酶标板（,4,孔,/,组），甩干孔内液体,以洗涤液（,200L/,孔）洗涤,3,次，,3min/,次,四、实验方法,3.,加待测血清：,标记各孔，加入相应液体,100L/,孔,1,2,3,4,阴性,待测,阳性,待测,4.,加单抗：,37,，,30min,甩干孔内液体,以洗涤液（,200L/,孔）洗涤,3,次，,3min/,次,各孔加入酶标单抗,100L/,孔,37,，,30min,5.,显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（,200L/,孔）洗涤,3,次，,3min/,次,加入底物溶液,100L/,孔,避光显色，,10min,加终止液,1,滴,6.,观察结果,取稀释好的被检血清,2,份和阴、阳性对照血清，每孔加入,100l,，置,37,温育,30,分钟。,洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液,200l,，静置,3,分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复,3,次。,每孔加酶标单抗,100l,，置,37,温育,30,分钟。,洗板：同步骤,2,。,显色与终止：每孔先加底物,A,液、再,B,液各,1,滴,(50l),，混匀，室温（,18-25 ,）避光显色,10,分钟后。,终止：每孔加终止液,1,滴,(50l),（,0.25%,氢氟酸），终止反应。,10,分钟内测定结果。采用波长,630nm,的酶标仪测定,OD,值。,结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均,OD,630,值与阳性对照孔平均,OD,630,值之差,0.4,。,S=,样品孔,OD,630,值，,N=,阴性对照孔,OD,630,值,如果,S/N,比值,0.6,，样品判定为,PRV,抗体阳性,;,如果,S/N,比值,0.7,但, 0.6,，样品可疑,;,如果,S/N,比值, 0.7,，样品判定为,PRV,抗体阴性。,五、结果与分析,阴阳性对照样品的,OD,630,?,S/N,?,，被检血清是阴,/,阳性？,结果与预期的不符，可能的原因是什么？,预期结果,阳性：无色,阴性：蓝色,1 2 3 4,阳性,阳性,阴性,被检,血清,？,底物显色,被检,？,？,ELISA,前血清样品,56,灭活,30,分钟。,在,ELISA,的整个操作过程中，洗涤非常重要,应该用力力甩干,以除去未结合的抗原、抗体和酶标抗体 。,加入底物液后应室温避光，结果判断须在,10,分钟内。,实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。,六、注意事项,思考题,间接,ELISA,和阻断,ELISA,有什么异同？,伪狂犬的抗体检测方法还有哪些？,