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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四,猪瘟的临床诊断,与防控技术,教师：曹胜波徐晓娟,蔡旭旺周洪波,华中农业大学动物传染病学教研室,猪瘟的间接血凝试验,一、实验目的,二、实验原理,三、主要器材,四、方法和步骤,五、结果判定与分析,六、思考题,实验目的,1.,掌握猪瘟病毒间接血凝试验的原理、操作方法和结果判定方法。,2.,了解猪瘟的常用诊断方法和技术。,间接血凝试验操作方法,孔号,1,2,3,8,9,10,11,12,稀释倍数,2,4,8,256,512,阳性,对照,阴性,对照,红细胞对照,稀释液,50,50,50,50,50,弃50,50,血清,50,50,50,50,50,50,50,红细胞,50,50,50,50,50,50,50,50,结果, ,一、猪瘟的诊断方法,流行病学调查。,临诊诊断,。,病理解剖学诊断。,实验室诊断。,病理组织学诊断,病原学诊断,血清学诊断,1. 流行病学：,（1）病毒来源。,（2）传播方式。,2. 临床症状：,（1）母猪：流产，产出弱仔、畸胎和死胎。,（2）哺乳仔猪：神经震颤、运动障碍、抽搐等。,（3）保育猪及育肥猪：发烧，便秘腹泻交替出现，腹下、耳及四肢内侧等少毛部位出血，发绀。,3. 病理解剖学诊断：,（1）脾脏：边缘梗死。,（2）,淋巴结：大理石样外观。,（3）肾脏：点状出血，“麻雀卵样肾”。,（4）浆膜、黏膜、心肺、膀胱：出血。,（5）回肠末端、盲肠和结肠：钮扣状溃疡。,4. 实验室诊断：,病原学诊断方法,（1）荧光抗体检测方法。,（2）,RT-PCR。,（3）荧光定量,PCR。,（4）,兔体交互免疫试验。,血清学诊断方法,（1）,ELISA：,阻断,ELISA、,双抗体夹心,ELISA。,（2）间接血凝试验,。,（3）中和试验,。,荧光抗体检测方法（,FA）,1.,猪瘟参考实验室推荐方法。,2.,采用冰冻切片或组织触片作免疫荧光试验。,3.,需在猪瘟弱毒疫苗免疫38天后采样，如为阳性才能判断为野毒感染。,野毒与疫苗毒鉴别,RT-PCR,1.,样品采集：扁桃体、公猪精液、流产胎儿等。,2.,样品保存：-20,。,3.,病毒总,RNA,的提取：病料组织研磨，反复冻融3次，离心取上清，按试验盒说明书提取,RNA，,避免,RNA,酶的污染（,DEPC，,无,RNA,酶产品）。,4.,RNA,反转录成,cDNA,。,5.,cDNA,的,PCR,扩增。,猪瘟病毒抗原检测,ELISA,1.,用抗,E2,糖蛋白单抗建立的双夹心,ELISA,。,2.,检测样品：,（1）组织样品：扁桃体、脾脏和肠系膜淋巴结。,（2）白细胞：抗凝血（肝素或,EDTA）,分离。,3.,按试验盒说明书做,ELISA。,猪瘟抗体阻断,ELISA,1.,酶标板系用经过免疫亲和技术纯化的重组,E2,糖蛋白包被。,2.,先加入待检血清，再加入辣根过氧化物酶结合的抗,E2,糖蛋白单抗及底物显色。,3.,颜色的,OD,值和血清样品中抗,E2,糖蛋白特异抗体的量呈负相关。,兔体交互免疫试验,1. 试验原理：,强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，而兔化弱毒能使家兔产生定型热反应，但对已产生免疫力的家兔则不产生体温反应。,2. 试验方法：,2.1,将病猪的病料用抗菌素处理后，接种家兔并每6小时测温一次，连续测3天，同时设注射生理盐水的对照兔。,2.2,7天后对所有家兔静脉注射,HC,兔化弱毒，同样每6小时测温一次，连续测温3天。,2.3,如试验对照免发生定型热反应，说明试验成立，可以分析判定结果。,兔体交互免疫试验,注射病料后,发热反应,注射弱毒疫苗后,发热反应,结果判定,无,无,猪瘟强毒,有,无,有,无,弱毒,有,其它致热源,兔体交互免疫试验结果判定,二、猪瘟的免疫预防（推荐）,1. 种猪：,（1）种公猪：春秋2次。,（2）种母猪：春秋2次；或每年3次；或产前2530天免疫；或产后2530天免疫,。,2. 后备种猪：,选留后，8月龄配种前加强免疫1次。,3. 仔猪：,（1）2060程序：20日龄一免，60日龄二免。,（2）070程序：乳前免疫，70日龄二免。,（3）03570程序：乳前免疫，35日龄二免，70日龄三免。,4. 发病猪场的免疫：,（1）紧急接种。,（2）乳前免疫（超前免疫、零时免疫）。,三、猪瘟的净化,三个阶段：,（1）猪瘟带毒调查阶段。,（2）猪瘟稳定控制阶段,。,（3）猪瘟全群净化阶段,。,（一）猪瘟带毒调查阶段,1.,根据病猪临床症状和病理变化，初步评估猪群野毒带毒状况。,2.,根据猪群10%抽检的猪瘟抗体监测结果，了解抗体合格率，抗体整齐度、离散度情况。,3.,抗体合格率低于90%，则进行全群检测，对抗体不合格的猪只，补免猪瘟疫苗6周后，第二次检测，抗体不合格的直接进行淘汰处理。,（二）猪瘟稳定控制阶段,1.,母猪群抗体合格率在90%以上。,2.,后备猪入群前进行猪瘟抗体的检测，不合格者补免一次，不合格不得留种。,3.,种猪群（母猪）10%的比例进行扁桃体采样，种公猪全群采样，分析猪瘟病毒带毒情况，野毒感染猪直接淘汰。,（三）猪瘟全群净化阶段,1.,对实施净化的种猪群逐头采取扁桃体，进行猪瘟检测，淘汰野毒感染猪。,2.,后备种猪采取扁桃体样本，进行逐头检测，阴性者方能留作种用。,3.,初步净化1年后，在育肥猪群中设立不免疫的育肥哨兵猪。,猪瘟的间接血凝试验,一、实验目的,二、实验原理,三、主要器材,四、方法和步骤,五、结果判定与分析,六、思考题,一、实验目的,1.,掌握猪瘟病毒间接血凝试验的原理、操作方法和结果判定方法。,2.,了解猪瘟的常用诊断方法和技术。,二、实验原理,1.,将可溶性抗原（猪瘟病毒）吸附于与免疫无关的红细胞表面，制成诊断试剂。,2.,致敏的红细胞与相应抗体相遇时，就会发生特异性结合，经过一定时间的相互作用就会出现肉眼可见的红细胞凝集现象。,间接血凝试验原理示意图,抗原致敏的方法,1. 致敏：,将抗原（或抗体）结合或吸附于红细胞表面。,2. 方法：,2.1,制备红细胞悬液：健康公绵羊血。,2.2,红细胞醛化：戊二醛。,2.3,鞣酸化：鞣酸（单宁酸）。,2.4,致敏。,三、主要器材,1.,血凝板（2人/块）,2.,猪瘟病毒阳性血清,3.,猪瘟病毒阴性血清,4.,被检血清,5.,醛化红细胞悬液,6.,稀释液,7.,移液器,8.,枪头,四、间接血凝试验操作方法,孔号,1,2,3,8,9,10,11,12,稀释倍数,2,4,8,256,512,阳性,对照,阴性,对照,红细胞对照,稀释液,50,50,50,50,50,弃50,50,血清,50,50,50,50,50,50,50,红细胞,50,50,50,50,50,50,50,50,结果, ,五、结果判定标准,1.,：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100%凝集。,2.,：红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐而稍向孔底集中，即75%凝集。,3.,：红细胞形成一个环状，四周有小凝集块，即50%凝集。,4.,：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25%凝集。,5.,：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。,不同程度凝集强度示意图,孔号,1,2,3,4,5,6,7,8,9,稀释倍数,2,4,8,16,32,64,128,256,512,结果, ,血凝价的判定,以出现（50%凝集）的血清最高稀释倍数为该血清的血凝价。,六、思考题,1.,常用的猪瘟诊断方法有哪些？,2.,间接血凝试验测定的猪瘟抗体效价对于猪瘟的预防、诊断与控制有何意义？,谢谢!,
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