RNA提取方法及原理

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,RNA提取方法及原理,John,1,1、研究背景,1.1 RNA研究的重要性,DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。,2,1.2 RNA分布,不同丰度,组织名称,样品量,总RNA含量,高丰度,肝脏,1mg,2-4g,脾脏,1mg,心脏,1mg,中丰度,大脑,1mg,0.05-2g,胚胎,1mg,肾脏,1mg,肺,1mg,低丰度,膀胱,1mg,0-0.05g,骨,1mg,脂肪,1mg,高丰度,成纤细胞,10,5,0.5-1g,人白细胞,10,5,中丰度,酵母,10,5,0.5-1.5g,拟南芥叶片,1mg,0.2-0.5g,低丰度,烟草叶片,1mg,0.05-0.1g,玉米叶片,1mg,3,2、方法及原理,2.1 RNA的提取流程,1、样本前处理,2、细胞裂解,3、 RNA的纯化及获得,4,RNA提取流程, 样品前处理注意点,选择新鲜血液，不得超过4,小时,选择新鲜的幼嫩组织,选择处于生长旺盛的时期收集细胞,选择新鲜组织，生长旺盛的组织,5,可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞,然后加入一定量的TRNzol，-70保存较长时间,去掉培养基，加入一定量TRNzol,-70 保存较长时间,推荐使用,专门的RNA样品,储存液,进行储存,液氮或加入RNase抑制剂中保存，,避免反复冻融,RNA提取流程, 样品前处理中如何保存样本,6,RNA提取流程,细胞裂解，以释放,RNA,异硫氰酸胍/酚,TRNzol总RNA提取试剂,独特配方-,RNAplant植物RNA提取试剂,胍盐/-巯基乙醇,RNAprep系列RNA提取试剂盒,7,RNA提取流程,RNA,的纯化及获得,RNA,纯化要求,1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质,2 排除有机溶剂和金属离子的污染,3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度,4 排除DNA分子的污染,8,2.2 RNA提取的注意事项,2.2.1 杜绝外源酶的污染,一：严格戴好口罩，手套。,二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。,三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。,9,2.2.2 阻止内源酶的活性,一：选择合适的匀浆方法。,二：选择合适的裂解液。,三：控制好样品的起始量。,10,2.3 Rnase 污染的10大来源,1：手指头,2：枪头,3：水/缓冲液,4：实验台面,5：内源 Rnase,6：RNA 样品,7：质粒抽提,8：RNA 保存,9：阳离子 (Ca, Mg),10：后续实验所用的酶,11,2.4 几种RNA提取方法,2.4.1 TRIzol法,TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。,12,TRIzol法提取流程,1 样品处理： （）培养细胞：收获细胞 1-510 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 5min 。 （）组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置 min 。,2 加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。,3 4 离心， 12000g 15min ，取上清。,4 加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 。,5 4 离心， 12000g 10min ，弃上清。,6 加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ， 7500g 5min ，弃上清。,7. 晾干，加入适量的 DEPC H,2,O 溶解（ 65 促溶 10-15min ）。,13,细胞,基因组DNA,水相,有机相,RNA,氯仿,纯化,pH5.7,离心,加入裂解液,(TRNzol-A+),实验流程图,细胞选择,贴壁细胞,悬浮细胞,14,2.4.2 苯酚法,细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。,15,苯酚法提取酵母RNA,取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4低温环境下，10000r/min 离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min 离心5min。,16,吸出上层清液，转入另一新Eppendorf 管，加2 倍体积95乙醇（含2乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。,17,2.4.3 异硫氰酸胍酚法,异硫氰酸胍酚法提取RNA的原理如下：GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库。,18,异硫氰酸胍酚法提取植物组织总RNA,1） 取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加45mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。,2） 置于冰上，顺序加入：50l 2mol/L NaAc , 混匀，0.5mL水饱和酚， 170l CI，混匀。置冰上15min。,3） 各管平衡后，4,12 000g离心20-30min。转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，20沉淀30min-1hr或80沉淀10min。4,12 000g离心20min回收RNA。,4） 用70乙醇洗一次，4，12 000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150l 异硫氰酸胍溶液，65吹打RNA沉淀溶解。,19,5） 加等体积异丙醇20沉淀30min-1hr或80沉淀10min。4,12 000g离心20min回收RNA。,6） 用70乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPCH2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于80冰箱中存放。,7） 紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析完整性。,20,植物病毒的RNA提取,大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。,21,一、材料,提纯TMV病毒液（10mg/ml）。,二、设备,冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。,三、试剂,TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA酶的双菌水。,22,操作步骤,1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4下12000g离心10分钟。,2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。,3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4下12000g离心10分钟。,23,4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-2030分钟。,5、4下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4下12000g离心5分钟。,6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。,7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。,24,动植物组织mRNA提取,一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织。,二、设备 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。,三、试剂 1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。,2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。,3、1层析柱加样缓冲液；20mmol/L TrisCl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。,4、洗脱缓冲液：10mmol/L TrisCl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。,25,操作步骤,（一）动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆,26,1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。,3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。,27,4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下7500g离心5分钟。,5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。,注意,1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。,2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年,28,谢谢,29,