细胞生物学实验-细胞融合课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,细胞融合实验,概念,促融合剂与融合技术,应用与意义,重点,一 定义：,Cell fusion,细胞融合,：,(Cell fusion),又称,体细胞杂交,（,somatic hybridization,）,是指将不同来源的原生质体,(,除去细胞壁的细胞,),相融合，,将两个或多个细胞合并成,一个细胞的技术。,人心肌细胞,人肝脏细胞,种内杂交细胞,人细胞,鼠细胞,种间杂交细胞,在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（,hybrid cell,）。,种内杂交细胞,（,intraspecific hybrid cell,）,:,同种细胞融合而成的细胞,种间杂交细胞（,interspecific hybrid cell,）,:,不同种的细胞融合而成的细胞,非对称细胞融合（,asymmetric fusion,）：,利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。,细胞核或细胞质失活的有物理和化学方法：,1.,物理方法，如,X,射线、,r,射线等，它们能使细胞核失活；,2.,化学方法，核失活碘乙酰胺（,IOA,）、碘乙酸,(Iodoacetate),；质失活罗丹明（,R,6,G,，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。,动物克隆,上海第二医科大学,陈莹博士,2003,年，她将一,5,岁男孩的包皮细胞与一只已去除细胞核,的新西兰兔卵母细胞融合，获得了人类早期胚胎。,二细胞融合的原理,荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验,将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素,(fluorescin),结合,人的抗体与发红色荧光的罗丹明,(rhodamine),结合；,显微镜下的细胞融合过程,细胞融合的过程,细胞互相靠近,细胞膜融合,细胞桥形成,细胞质融合,细胞核融合,细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合主要步骤。,细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步,，融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥。,细胞融合过程中两个细胞膜的变化,形成细胞桥的具体变化,细胞融合分为两种：,1.,自发细胞融合,2.,人工诱导细胞融合,（,1,）自发细胞融合,自发细胞融合（,spontaneous cell fusion,）是在,未施加任何诱导条件,的情况下所发生的细胞融合现象。,自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要有以下几种情况：,1.,精子和卵子受精,2.,肌管的形成,3.,胚胎着床,4.,巨细胞的形成,5.,破骨细胞的形成,6.,肿瘤细胞融合,（,2,）诱导细胞融合,人工诱导细胞融合是在,人为条件下,发生的细胞融合现象,常用的诱导方法有三种：,1.,生物法（病毒诱导法等）,2.,化学法（,PEG,诱导法、,Ca,2+,诱导法、,溶血卵磷脂诱导法等）,3.,物理法（电诱导法等）,1.,病毒诱导法,常用的病毒：仙台病毒（,Sendal virus),又称日本血凝病毒,（,Hemagglutinating virus of Japan,HVJ,）,属于副粘液病毒科，,RNA,病毒，圆球形,1962,年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙台病毒可诱导细胞融合。,病毒促使细胞融合,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透,-,细胞核互相融合 ，进入正常的细胞分裂途径，杂种子细胞,。,2,化学法（聚乙二醇）,PEG:,聚乙二醇（,polyethylene glycol, PEG,）,分子式：,HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH,性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、沉淀蛋白质的作用,分子量,1000-6000u,，可作诱融剂。,20,世纪,70,年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合,分子量小的,PEG,，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。,pH,偏碱时融合效应最高。,用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为,4000,者，常用浓度为,50,，,pH8.0pH8.2,聚乙二醇,普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂 类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合,基本原理,聚乙二醇,(PEG),是一种多聚化合物，商品名卡波蜡,(Carbowax),。,聚乙二醇（,PEG,）介导的细胞融合,原理：,PEG,带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高,pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的,PEG,分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。,融合过程中应注意,事先要做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。,原生质体的密度应在,10,5,个,mL,左右，两种原生质体按,1,：,1,等量混合。,常用,PEG,的分子量通常为,40006000,，加热熔化与,Eagle,溶液配成,50,(W,V),浓度,(,小分子质量的,PEG,配成,55,浓度,),。加入,PEG,后，,24,培育,1020min,注意时间宜短不宜长，过长，使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低融合率,),，缓缓加入高,pH,、高钙离子溶液,15min,后用冲洗液清洗，离心收集原生质体。,3.,物理法一电融合诱导法,1981,年，,Scheurich,和,Zimmermann,发明了电诱导细胞融合。,电融合槽,在直流电脉冲的诱导,下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。,细胞电融合,原理：,悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在,1,100MHz,和,100,1000V/cm,的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向发生,双向电泳,，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生,可逆电降解,，从而触发细胞融合。,+,-,+,-,+,-,+,-,-,+,偶极子,电诱导法原理,+,-,-,+,双向电泳：,在交流电场的作用下（,1MHz,，,150V/cm,）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。,原生质体电融合过程,1,）在高频电流电场下的相互接触。,2,）脉冲刺激后,30s,3)50,秒后,4,）,1.5,分钟后,5,）,6,分钟后,6,）,15,分钟后，原生质体融合完成。,注意事项,1,）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。,2,）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。,优点：,融合率高，达,70,80,，甚至,100,可在显微镜下定向诱导细胞融合,可直接挑选杂种细胞,重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单；免去,PEG,诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。,融合指数,（,fusion index,）,:,反映细胞融合的效率,有两种计算方法：,1.FI=,（对照组细胞数,-,试验组细胞数）,/,试验组细胞数,2.,FI=,多核细胞中的细胞核数,/,所有细胞中的细胞核数,不同细胞融合的条件及其主要应用,来源 前处理 融合的方法 主要应用,动物细胞 不需 仙台病毒,PEG,，电融合 生产单克隆抗体,植物细胞 脱壁,PEG,电融合 创造植物新品种,微生物细胞 脱壁,PEG,高产优质新菌种,A,A,B,B,A,A,B,B,B,A,A,B,同核体,同核体,异核体（杂交细胞）,未融合,未融合,加入融合剂,融合细胞的类型,同核体：,由同一亲本细胞融合而来,异核体：,（,heterokaryon,）,有不同亲本细胞融合而来,异核体其细胞膜融合在一起，而融合的细胞含有两个不同的细胞核。,动物细胞融合,影响因素,动物细胞融合中，除促融剂外，其他如细胞性质、温度、,pH,、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。,亲本细胞表面性质影响较大,细胞种类不同，融合效果也不同,，,如腹水癌及株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。,细胞融合时需要适宜温度和运动状态。,如仙台病毒诱导,-,腹水癌细胞融合时，于,37,振摇时易于融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在,34,振摇则融合率下降。在,37,时不振摇则,-,不融合。,细胞融合过程中，,通常耗氧量较大,，缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于,20,时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件也可融合。,有些细胞融合时需要,Ca,2+,，否则不融合,，细胞蛋白质亦发生变化。,实验表明,Sr,2+,、,Ba,2+,、,Mg,2+,、,Mn,2+,等离子可代替,Ca,2+,，但有效浓度较,Ca,2+,大的多。融合时最适合的离子强度一般为,0.1mol/L,。,最适合的,pH,为,7.4-7.8,之间,，在此范围之外，融合率均较低。,比较常用的杂种细胞筛选方法,1,遗传互补筛选法：,2,营养互补筛选：,3,温度敏感筛选法,1,）,遗传互补筛选法：,利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。,亲本,A,：,HGPRT,-,/TK,+,亲本,B,：,HGPRT,+,/ TK,-,杂交细胞：,HGPRT,+,/ TK,+,在,HAT,培养基中杂交细胞存活，,A,、,B,死亡,2,）,营养互补筛选系统：,细胞在缺乏一,种或几种营养成分时，不能生长繁殖,即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细,胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。,亲本,A,：色氨酸缺陷型,亲本,B,：苏氨酸缺陷型,杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。,3,）,温度敏感突变型,杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在,32,度到,40,度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。,亲本一：低温敏感突变型，可在低温下生长，在高温下死亡。,亲本二：高温敏感突变型，可在高温下生长，在低温下死亡。,杂种细胞能在高温和低温下生长。,细胞融合的应用,1.,用于基因定位,2.,用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗,2.,用于动物育种,3.,用于细胞治疗,4.,用于生产单克隆抗体,5.,用于研究核质关系和肿瘤发生机制,细胞融合应用,一,.,单克隆抗体,1975,年英国科学家,Milstein,和,Kohler,将产生抗体 的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗 体技术，而获得,1984,年诺贝尔医学和生理学奖。,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984,for the discovery of the principle for production of,monoclonal antibodies,Georges J.F. Koehler,Federal Republic of Germany,Basel Institute for Immunology Basel, Switzerland,b. 1946 d. 1995,Car Milstein,Argentina and United Kingdom,MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom,b. 1927(in Bahia Blanca, Argentina)d. 2002,科莱尔,米尔斯坦,单克隆抗体的概念,单,:,单个细胞,克隆,:,无性繁殖,抗体,:,化学性质单一、特异性强,亲本细胞的准备,细胞融合,杂交瘤细胞的筛选,可分泌特异性单克隆抗体,的杂交瘤细胞的筛选,杂交瘤细胞的克隆化培养,单克隆抗体的生产和纯化,生 产 过 程,单克隆抗体的大量制备过程,一 细胞融合前准备,(,一,),动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备,在腹腔免疫,1,2,次后的,2,4,周，于融合前,3,4,天加强免疫一次，这样可以使抗原最近激活的,B,淋巴细胞定位于脾脏，也使记忆细胞处在激活与分裂状态。许多资料结果表明，脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤的最佳时间，是在抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性抗原的免疫量常为,10-100ug,，经皮下或腹腔注射免疫,1-2,次（间隔,2-3,周），,3,周后,50-500ug,抗原加强免疫，加强免疫一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原到达脾脏。细胞抗原常用,2 10,7,用细胞腹腔注射，不需佐剂。,一般取最后一次加强免疫,3,天以后的,脾脏,，制备成细胞悬液。,淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。,免疫方法：体内法或体外法。,体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。,3,4,天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在,95,以上的可以用于融合。,体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为,10,7,个,/ml,，加适当浓度抗原，,3,4,天后，收集被刺激的淋巴细胞。,小牛血清的选择,供血的新生小牛必须是健康牛的产仔，并在产后,24,小时内抽血，此期间不得吸取母乳。,以无菌操作自颈动脉放血，并在无菌条件下分离血清及滤菌，全过程在,36,小时内完成。经滤菌的血清置,20,保存。血清使用前需做细菌、支原体培养及内毒素测定，在确实无污染的情况下方可使用。,每批小牛血清测定总蛋白含量并分别配成,10,、,20,、,25,于基础培养基和,HAT,培养基中，对骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞进行培养，观察小牛血清对瘤细胞和融合细胞的细胞毒性。,轻微溶血的血清，而无细胞毒性者仍可应用。,在用血清做细菌培养时，应置于细胞培养瓶内进行，培养期间随时可放于倒置显微镜下观察，可避免由于肉眼观察的疏忽。,B,淋巴细胞的准备,红细胞,将红细胞注入小鼠皮下或腹腔,取出脾脏,B,淋巴细胞,亲本细胞的准备,(,二,),骨髓瘤细胞的获得与培养,骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一晶系小鼠腹腔内产生大量,McAB,。,骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细胞培养液。小牛血清的浓度一般在,10,20,，细胞的最大密度不得超,10,6,个,ml,，一般扩大培养以,1,：,10,稀释传代，每,3-5,天传代一次。细胞的倍增时间为,16-20h,。,亲本细胞的准备,骨髓瘤细胞的准备,骨髓瘤细胞：是癌变的浆细胞，可以分泌免疫球蛋白，所以必须选择 不分泌免疫球蛋白的缺陷型 骨髓瘤细胞，,多用,BALB/C,小鼠的骨髓瘤细胞。,细胞融合,加入,PEG,作融合剂,B,淋巴细胞,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,1,2,3,4,二 细胞融合,融合条件除了融合剂以外，还包括温度、培养基和培养板等。我们首先分析用,PEG,作融合剂时的条件选择。由于作用时间不一样对细胞的毒性也不一样。用于融合的分子量一般在,1000,4000,，一般作用浓度在,35,50,之间，,PEG,作用,1,2,分钟，以,PH8.0,8.2,时融合率最高。,小白鼠脾臟細胞,B,與 癌細胞,N,以,PEG,進行融合，操作在,10 min,內完成,(,如下圖,),，隨即把細胞平均分配在,96,槽細胞培養盤,中,细胞融合：,1.,脾细胞的准备；拉颈处死小鼠；无菌操作取出脾脏；清洗、研磨。,2.,制备脾细胞悬液,:,收集细胞；离心洗涤；细胞计数。,3.,准备骨髓瘤细胞,:,收集细胞；离心洗涤；活细胞计数；调整细胞浓度，骨髓瘤细胞与小鼠脾胞按一定比例混合。,4.,细胞融合剂的选择： 病毒，,PEG,。,5.,细胞融合：在聚乙二醇作用下各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。,将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以,2,：,1,或,10,：,1,的比例混匀于,50ml,锥形离心管内。,1200rpm,离心,7,10,分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层。,在室温条件下边轻轻振摇离心管边在,60,秒钟内逐滴加入,50%,的,PEG 0.5ml,，随后静置,90,秒。,再于,5,分钟内边振摇边逐滴加入,5,10ml,不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止,PEG,的作用，再静置,10,分钟。,融合细胞的早期观察及其异常结果分析：,1,融合后的细胞早期观察与管理；,2,无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析；,3,转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞生长；,4,不出现杂交瘤的原因分折。,三 杂交瘤细胞的筛选,融 合,将细胞转移到,HAT,培养基中培养,HAT,1,2,3,4,HAT,培养基筛选杂交瘤细胞,细胞团块分散后，加,HAT,溶液,，稀释至骨髓瘤细胞不超过,210,5,ml,，即可加入有饲养细胞的,96,孔塑料培养板内每孔,0.1ml,，如是,24,孔板，每孔,0.5ml,；总量分别为,0.2ml,和,1ml,。,用,HAT,选择性培养时每隔,2,3,天半量换液，,7,天后可以选择出杂交瘤细胞。,HAT,选择系统,HAT,是含一定浓度,次黄嘌呤（,H,）,、,氨基喋呤（,A,）,及,胸腺嘧啶核苷（,T,）,的一种,选择性培养基,，其中三种成分与细胞,DNA,合成有关。,DNA,合成途径有两种。,杂交瘤技术中，常选用,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（,HPRT,-,）,骨髓瘤细胞或,胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（,TK,-,）,骨髓瘤细胞为亲本之一。,HPRT,-,细胞的嘌呤只能由,全合成途径,产生；,TK,-,细胞的嘧啶只能由,全合成途径,合成。,含氨基喋呤培养基,抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。,淋巴细胞具有合成,DNA,的两条途径。,杂种细胞通过互补作用获得,HRPT,或,TK,基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过,补救合成途径,合成,DNA,。,在,HAT,培养基中，,HPRT,-,或,TK,-,亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有,杂种细胞存活,。,四 可分泌特异性单克隆抗体,的杂交瘤细胞的筛选,HAT,将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法,有：放射免疫测定、酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。,融 合,五 杂交瘤细胞的克隆化培养,1 2 3 4 5 6,融 合,HAT,杂交瘤细胞的克隆化培养,利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。,在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的,饲养细胞,，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。,方法有,有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪,等。,克隆化的目的,1,） 是细胞建株的必经过程，以得到遗传特征相同的细胞；,2,） 就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源的杂种细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细跑。,3,） 减少非分泌型无关细胞生长过快。,注意事项：待克隆细胞生长处于对数增长期；小牛血清的质量和浓度；细胞计数要准确；及时观察细胞生长情况。,饲养细胞的种类和作用对于培养小鼠细胞来说，主要有下列各种细胞可供作为其饲养细胞：胸腺细胞,用量为,106/0.2ml,正常的脾细胞；传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞；腹腔细胞其用量为,2104/0.2ml,，腹腔细胞是使用得最普遍的饲养细胞。,胚胎成纤维细胞因在细胞培养条件下有分裂增殖的能力，故只适应于软琼脂平板法培养中，该细胞铺于平板的底层。,饲养细胞的作用提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。,1.,有限稀释法,稀释,1,）有限稀释法,有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到,10,个,/ml,，然后装成每小孔,(96,孔板,) 0.1ml,，使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形成集落 。有限稀释法举例：,1.,取,1.0 ml 5104ml,细胞,+4ml,培养基稀释， 得,1104/ml.2.,取,0.5ml 1104ml,细胞液,+4.5ml,培养基稀释， 得,1103/ml.3.,取,1.0ml 1103ml,细胞液,+4.5ml,培养基稀释， 得,1102/ml.,2,.,软琼脂培养法,在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层,0.5,的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的,0.25,的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的,96,孔板内。,2,）软琼脂培养法：,本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率较高，速度较快。但缺点是克隆率不高。基本原理是利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出来,(,一般,8,10,天后,),，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。也可以用溶血空斑技术或围绕集落形成免疫沉淀的方法来直接测它的活性。,3.,显微镜操作法,3,）显微镜操作法,在倒置,(,或解剖,),显微镜下，借助于毛细吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的,96,孔培养孔内，根据原理不同，又分为普通法和玫瑰花结两种方法。普通显微镜操作法：于,6cm,平皿中，假如约,10,3,个细胞；,CO2,培养基箱中静置,1,小时左右无菌条件；在倒置显微镜下去平皿盖用直角转头滴管，吸出单个细胞移至预先加有饲养细胞的,96,孔板内直至,96,孔均分装有细胞，加盖；于,CO2,培养箱内培养观察与更换培养方法同有限稀释法。玫瑰花结原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体，在,定的条件下常可与特异性抗原致敏的羊红细胞形成玫瑰花结。如果从免疫动物的脾细胞中除去能形成特异性玫瑰花结的细胞则失去对特异性抗原的反应性。,4.,荧光激活分离法,荧光激活细胞分离器法,(Fluoresemu activated Cell Sortu,，,FACS),用本仪器分离单细胞的原理是将悬液中的细胞引入一种液流的中央，使其一个接一个地通过聚焦的高能激光束，根据荧光和光放射的性质快速分析和分离细胞。,5,）盖片分离法,1.,用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖片；,2.,选择碎块、大小形态适用的选出；,3.,加培养液及进行细胞培养；,4.,倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片；,5.,进行单个细胞培养。,大量生产单克隆抗体：,(1),体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从,上清,中获取单克隆抗体；,（,2,）体,nei,杂交瘤细胞制备,腹水或血清,1),实体瘤法：,对数生长期的杂交瘤细胞接种于小鼠背部皮下，每处注射,0.2ml.,肿瘤达到一定大小后则可采血，从血清获得单,克,隆抗体。,2,）,腹水的制备：,腹腔注射,1x10,6,杂交瘤细胞，按种细胞,7-10,天后可产生腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达,5-20mg/ml,，可以将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。,避免夭折的方法可采用：换液动作轻柔、换液量不超过,1/2,；避免反复取出,CO2,培养箱，不宜经常换液；不轻易更换新批号小牛血清。及时判断阳性孔也是一项重要的工作，可起减少工作量和保证重点杂交细胞双重作用，待集落生长到,96,孔板孔,1/3,左右，,24,孔板,1/5,左右，就要及时测定各孔上清中是否会有特异性抗体，一旦发现抗体阳性孔，就应立即扩大培养，再冻存和克隆化，以免被其他细胞生长所压抑或意外丢失。,无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析：融合后经,HAT,选择有细胞克隆出现，但不能筛选出产生特异抗体的杂交瘤，常见原因是：抗体检测法不够敏感； ,HAT,选择失败；染色体丢失和克隆竞争；动物免疫不成功。,杂交瘤细胞产生,单克隆抗体示意图,单克隆抗体的应用,主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点。如；各种癌症、肝炎病毒、,SARS,病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别,“,自己,”,与,“,异己,”,，一旦发现 致病因素便与之结合将其杀死。,若在单抗上带上抗癌药物制成,“,生物导弹,”,，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞,美国科学家采用细胞融合技术将番茄和马铃薯的细胞融合在一起，培育出称之为,“,番茄薯,”,或,“,薯番茄,”,的新型植物。植株地上部结番茄，地下部生长根茎，产量高，品质好。,动物细胞融合与单克隆抗体,思考与探究,1.,植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。,2.,制备单克隆抗体时，为什么要选用,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？,提示：哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的,B,淋巴细胞，,B,淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种,B,淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的,B,淋巴细胞大量增殖。,B,淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖,骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。,因此，把一种,B,淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。,3,已成功的动物细胞融合实例还有哪些？,生物种类 细胞来源 成功年代,酵母菌,鸡 原生质体,血红细胞,1975,年,人,胡萝卜 腹水癌细胞,原生质体,1976,年,人,小鼠 纤维肉瘤细胞,畸胎瘤细胞,1978,年,4.,为什么不用两个而用多个细胞进行细胞融合？,就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是,100%,。,仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个,B,淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含,B,淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,5.,杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用,“,有限稀释法,”,来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行,3,4,次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,这样的人畜细胞融合会造成什么后果？,4,位专家分析指出：,首先，某些目前未知的兔子疾病将传染给人类，就像艾滋病病毒可能是从非洲猩猩而来。,尽管中山医科大学把胚胎用于治疗性克隆研究，但万一被居心叵测者植人人类子宫，就可能产生一个人兔杂交种。,“,这完全是对人类尊严的亵读。,”,精子和卵子受精,肌管,破骨细胞,是由好几个,细胞,融合,巨 细 胞,骨巨细胞瘤,骨巨细胞瘤,绿色箭头所指为正在融合的间质细胞,附录：,蟾蜍血红细胞,鸡血红细胞,实验步骤,1.,试剂：,(1)Alsver,液：葡萄糖,2.05 g,，柠檬酸钠,0.8 g,，氯化钠,0.42 g,，加重蒸水至,100 mL,即可。,(2)GKN,液：氯化钠,8 g,，氯化钾,0.4 g,， 磷酸氢二钠,1.77g,，磷酸二氢钠,0.69g,，葡萄糖,2 g,，酚红,0.01 g,，溶于,1000mL,重蒸水中。,(3)Ringer,溶液：二氯化钠,0.25g,，氯化钾,0.42g,，氯化钠,6.5g(,恒温动物,9g),溶于,1000 mL,蒸馏水中。,(4)50,PEG,混合液：称取少许,PEG(Mw 4000),放人刻度离心管内，在沸水浴中加热， 的等体积的,GKN,液，混匀。,实验步骤,1.,细胞悬液的制备：,(1),蟾蜍血红细胞悬液制备：注射器吸,1mLAlsver,液后，从蟾蜍主动脉弓取血,1mL,，再加入,2mLAlsver,液放入刻度离心管内，按照,3,：,1(V,V),加入,6mL Alsver,液混匀，放入,4,冰箱内可保存,3-4,天。,(2),鸡血红细胞悬液的制备：用注射器吸入,1mLAlsver,液后从鸡翼下静脉取血,2mL,，注入刻度离心管内，按照,3,：,1(V,V),加入,6mL Alsver,液混匀。,2.,取细胞悬液,1mL,，移入,10mL,离心管， 加,4mL0.85,生理盐水。,1500r,min,离心,5 min,。,3.,弃上清液，加,0.85,生理 盐水至,5mL,，混匀后,1500r,min,离心,5min,。重复再离心洗涤,1,次。,4.,收集最后,1,次离心沉淀的血细胞，加适量的,GKN,液或,Ringer,溶液，按压积红细胞体积配成,10,的红细胞悬液。,5.,取悬液,1mL,到,1,个试管中，加入,0.5,0.8 mL,预热的,50,PEG,混匀，置于,30,水浴,2min,； 再加入,Ringer,或,Hanks,液,5ml,以终止,PEG,的作用,;,取血细胞悬液,1,滴滴于载玻片上，再加入,0.2%,次甲基蓝溶液,1,滴,盖上盖玻片。,6.,显微镜,(,高倍,),观察,2,个或,3,个靠近细胞融合过程。,7.,进行多个视野的测定，统计平均融合,