-药用植物原生质体培养

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第五章 原生质体培养与体细胞杂交,教学内容,1.掌握原生质体的概念，了解原生质体培养的开展史,2.掌握原生质体的别离途径和纯化方法；掌握原生质体活力测定方法；,3.掌握原生质体培养的方法、原生质体融合方法、杂种细胞筛选及杂种植株鉴定方法。,原生质体Protoplast概述,原生质体概念：去掉,细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。,1880,年，,Hanstein,首次起用原生质体,(protoplast),一词。,1960,年，,Cocking,首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。,1971,年，,Takebe et al.,首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。,1985,年，,Fujimura et al.,第一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株。,1986,年，,Spangenberg et al.,单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。,原生质体培养开展简史,据统计，目前全世界已有49个科，160个属的367种植物经原生质体培养得到了再生植株。其中成功报道最多的是茄科，其次是豆科、禾本科、菊科、十字花科、伞形科等。,我国的开展概况：,原生质体培养的再生植株:烟草、胡萝卜、矮牵牛,原生质体融合：小麦蚕豆、小麦玉米、水稻豌豆,第一节、原生质体别离及纯化,1. 原生质体别离,双子叶外植体,愈伤组织,多数植物别离原生质体的经典材料叶肉细胞,温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。,无菌苗的叶片更具优势。,上胚轴和子叶,1.1,材料来源,禾本科植物,：,愈伤组织,或悬浮细胞,。,材料预处理,用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。 龙胆试管苗的叶片用4oC处理较好。 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后别离的原生质体才能分裂。 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后别离原生质体，才能获得高产量。,别离方法,机械别离法,酶法别离法,机械别离法Mechanical isolation,机械别离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁别离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。,机械别离法的优缺点,优点：能排除酶对原生质体的破坏作用,缺点：,局限性大，只限于能够广泛发生质壁别离的组织，不能从成熟的和分生细胞别离原生质体；,原生质体的产量低；得到的原生质体有限；,方法繁琐费力。,酶法别离Enzymatic isolation,酶法别离：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。,酶别离法使用的酶,种类：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶类、 崩溃酶、 蜗牛酶,果胶酶：是从根霉、黑曲霉中提取的,使细胞间的果胶质降解,把细胞从组织内别离出来。,纤维素酶：是从绿色木霉中提取的，降解细胞壁中纤维素的酶。,酶,来源,生产厂家,果胶酶类,Macerozyme R-10,根霉,Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan,Pectinase,黑曲霉,Sigma Chemical Co.,Pectolyase Y-23,黑曲霉,Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan,半纤维素酶,RhozymeHP-150,黑曲霉,Rohm and Hass Co., Rhiladelphia, UAS,酶,来源,生产厂家,纤维素酶类,Onozuka R-10,绿色木霉,Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan,Cellulysin,绿色木霉,Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA,Driselase,Irpex lutens,Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan,酶液的配制,渗透压,稳定剂,酶的配比,及浓度,酶解液的组成及浓度,酶的混合液,纤维素酶1%-2% 浓度、果胶酶%- 0.5%浓度等。,渗透稳定剂促进酶解，保持原生质体的完整性。,甘露醇、山梨醇、葡萄糖等， 适宜的浓度为450-800 mmol/L。,盐类增加膜的透性氯化钙、氯化镁。,酶组合,、浓度,材料,纤维素酶,半纤维素酶,崩溃酶,果胶酶,离析酶,蜗牛酶,研究者,烟草叶片,禾谷类叶片,油菜花粉,马铃薯子叶,马铃薯花粉,1.0,2.0,1.0,1.0,1.0,0.5,1.0,0.10.2,0.5,0.5,1.0,Uchimiya,Scott,李仕琼,戴朝曦,王蒂,几种草本植物原生质体别离使用的酶种类及浓度(%),材料,纤维素酶,半纤维素酶,崩溃酶,果胶酶,离析酶,研究者,枸杞愈伤组织,檀香幼叶,檀香愈伤组织,榆幼叶,山毛榉幼叶,胡杨悬浮细胞,0.5,2.0,1.0,0.10.2,1.0,0.5,0.5,0.5,0.2,0.5,0.05,0.5,0.5,0.010.03,0.1,1.0,0.2,0.5,0.5,孙勇如等,Lakshmi,Lakshmi,Dorin,Ahuja,诸葛强,几种木本植物原生质体别离使用的酶种类及浓度(%),酶解法别离原生质体,两步别离法,用果胶酶离析植物组织，收集细胞，经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。,酶解法别离原生质体,一步别离法,一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。,原生质体别离(一步别离)过程图示,以叶片为例,过滤、离心,加果胶酶,和纤维素酶,原生质体的别离步骤,一取材叶肉细胞,充分展开的嫩叶。,洗涤、消毒、无菌水冲洗。,对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵Zephiran0.1%,- 酒精10%溶液漂洗5分钟效果最好。,二酶解,材料 撕掉下表皮 -修剪成2cm见方小块 置于6cm直径培养皿中(下外表朝下0.5g) 加2ml酶解液置于25-27下保持3-4小时左右轻轻震荡原生质体释出。,酶解法的优点,1能够容易地大量地得到原生质体,2条件温和，完整性好，有活力。,3几乎可以从任何组织只要细胞还没有木质化别离出原生质体。,现为最常用的进行原生质体别离的方法。,影响酶活性和酶解效果的因素,PH,值：之间,温度：植物所需温度为,25-30 ,时间：,30,分钟,-20,小时,用量：,1g,鲜组织用,10ml,酶解液的效果很好。,2.,原生质体纯化与活力测定,原生质体纯化,酶解后的混合物中将含有完整的原生质体、亚细胞碎屑叶绿体、维管成分、未被消化的细胞等，因而必须将这些杂质除去。,初步筛选：利用50-70m孔径的镍丝网过滤混合物，收集滤出液，做进一步的纯化。,原生质体纯化方法,离心沉淀法,漂浮法,离心沉淀法,原理：原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。,步骤：,原生质体溶液用400目网筛过滤。,离心500-1000r/min，离心5-6min。,吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。,用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。,离心沉淀法,优点：纯化原生质体操作比较简单。,缺点：由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。,漂浮法,原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液如蔗糖浓度21%使原生质体漂浮在液体的外表。,步骤：,400目网筛过滤。离心。,吸取上层液，洗涤液重悬，离心沉淀。重复23次。,收集溶液外表原生质体，用培养液洗1次。,叶肉原生质体别离纯化漂浮法,优点：,可以减少别离的原生质体因离心被组织碎片撞击而破损情况的发生。,所用药品简单，本钱低。,缺点及补救措施：,对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体那么不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。,漂浮法的优缺点,纯化后的叶肉原生质体,原生质体活力测定,形态识别法,形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。,染色识别法,0.1%酚番红或伊凡蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。,双醋酸盐荧光素FDA，0.01%染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。,原生质体活力测定,第二节 原生质体培养,1.,培养基,碳,源,：葡萄糖,氮源,：谷氨酰胺,生长物质,：生长素与细胞分裂素,钙源,：,CaCl,2,可,增强稳定性，提高分裂频率，明显改变细胞质内外的离子交换。,渗透压,：高渗溶液,，通常,的渗透剂是,甘露醇和山梨,醇，,调节渗透压。,pH,：,KM-8p,培养基,2.,培养方法,液体浅层培养,原生质体,悬浮液,1mm,厚液体培养基,10,5,个,/ml,液体浅层培养的优缺点：,优点：,吸收营养物质的能力强，表现出较强的细胞分裂能力；且易于添加新鲜培养基和转移培养物。,缺点：,分布不均匀，发生原生质体之间的粘连现象而影响生长和发育；难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。,平板培养,原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖37C左右等体积混合成0.7%，培养于培养皿中。,优点：,原生质体处于固定位置，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察,缺点：,通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟,2d,左右。,平板培养的优缺点：,双层培养法固、液培养,培养皿底部铺一层,0.7%,琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。,固体培养基,优点：,固相培养基可以补充液相培养基的营养；固相中如果参加活性炭，可吸收培养物释放的有毒物质。,缺点：,不易观察细胞的发育过程。,双层培养法固、液培养的优缺点,X-射线杀死某种植物细胞中的核，但细胞可正常代谢，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层固体，再将要培养的生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合液体，培养于饲养层上。,饲养层培养看护培养,微悬滴法培养,方法：,吸取,原生质体的悬浮液，滴于,6cm,直径的培养皿的盖上，液滴大小,20-50,l,左右，悬滴培养,。原生质体在液滴的中央生长。,为了,防止培养基迅速蒸发，可以在培养基的底皿里加液体培养基保湿,。,3. 培养条件,KM-8p培养基，2527，最初两周暗培养壁的形成和细胞再生；分化时补充光照培养光照16h/d，注意KM-8p在强光下对植物有毒最初几天经常摇动，以助透气。,原生质体再生过程,原生质体,完整细胞有细胞壁,细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成,植株再生,第一次分裂,第二次分裂,第三次分裂,多细胞团,原生质体再生细胞壁后的分裂,肉眼可见细胞团,愈伤组织,器官发生途径,胚胎发生途径,植株,植株再生途径,原生质体融合：也叫做体细胞杂交，即用别离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。,第三,节 原生质体融合,1.,原生质体融合的意义,克服杂交不亲合,克服生殖器官败育,对品种的改进，培育新品种,番茄,+,马铃薯,白菜,甘蓝,原生质体融合,甘薯原生质体融合植株,去掉细胞壁,原生质体融合,2.,原生质体融合方法,无机盐诱导融合,电融合技术,无机盐诱导融合：,NaNO,3,法,1972,年：,Carlson,用此方法诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。,NaNO,3,的作用,：中和原生质膜的,负电荷,，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起。此方法诱导频率不高。,电融合技术,Senda 1979,年首先用此方法实现原生质体融合,细胞融合仪,电融合法原理,交流电场使原生质体外表电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。,+,-,负极,正极,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,3.,杂种,细胞筛选与鉴定,融合后的混合产物中有同核体、异核体，应加以选择，筛选出杂种细胞。,胞质杂种,体细胞杂种,A,B,射线照射,B,射线照射,A,异核体,3.,杂种,细胞筛选与鉴定,互补,选择法,双,荧光标记选择法,杂种细胞的筛选方法,互补法筛选,利用,2,个亲本对培养基成分、抗代谢物、或温度等的敏感性存在着天然的互补性进行选择叫互补法选择。,1激素自养型筛选,粉蓝烟草和郎氏烟草的野生型叶肉细胞原生质体是激素异养型细胞，且原生质体不分裂；,杂种细胞是激素自养型细胞，且在没有激素的培养基上可以旺盛分裂。,使融合产物在不含激素的培养基上培养，能够产生细胞团的就是融合的原生质体。,两步法激素自养型筛选,2 营养缺陷型互补筛选,硝酸复原酶的蛋白突变体和辅因子突变体，突变体不能利用硝态氮，只能利用铵态氮。,两者的突变位点不同，原生质体融合后，硝酸复原酶恢复，可以利用硝态氮。,3 利用对抗代谢物质的敏感性互补进行筛选,Petunia parodii,矮,牵牛,1,Petunia hybrida,矮,牵牛,2,在,MS,培养基中可以形成肉眼可见的愈伤组织团,在,MS,培养基中只形成很小的细胞团，不能进行生长,参加1g/L放线菌素-D，原生质体完全不能分裂,参加1g/L放线菌素-D，原生质体的分裂不受影响,在参加1g/L放线菌素-D的培养基中培养，能够进行生长的愈伤组织即为体细胞杂种,原生质体融合,异硫氰酸荧光素FITC：绿色,异硫氰酸罗丹明RITC：红色,双荧光标记选择法,双荧光素标记,4.,体细胞杂种植株的鉴定,形态学鉴定,细胞学观察,DNA,图谱分析,同工酶分析,形态学鉴定,细胞学观察,染色体形态和数目的比较,18,条染色体,36,条染色体,DNA,图谱分析,RAPD随机扩增的多态性DNA带型,同工酶谱分析,将体细胞杂种的同工酶谱与其双亲的酶谱比较：,杂种植株的酶谱可能是双亲酶谱带的总和,可能只出现双亲的局部酶带,或缺少双亲的某些酶谱而出现新的谱带,思考题,1、说明原生质体别离机械别离法和酶别离法的特点。,2、原生质体纯化方法有哪些？原生质体活力的测定方法有哪些？,3、简述原生质体培养方法及特点。,4、体细胞杂种植株如何鉴定？,