32P后标记DNA加合物的

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/7/4,#,32,PDNA,加合物的,检测技术,1,1.DNA,加合物,DNA,加合物是指环境化合物直接或经体内代谢,以及体内自身产生的亲电性活性有毒化合物,与,DNA,碱基上亲核的位点特异性结合形成的共价结合物。可与,DNA,发生加合作用的化学物质包括：烷化剂，多环芳烃，苯乙烯氧化物，醌类，醛类，黄曲霉素，,N-,亚硝基化合物，杂环芳香胺和丙烯酰胺等。,2,四种碱基上易形成加合物的位点如同所示。,3,DNA,加合物是,DNA,化学损伤的最重要的形式，并是引发肿瘤过程的病理原因，若形成的,DNA,加合物不能被生物系统的修复酶及时修复,会引起相关基因发生突变，因此具有遗传毒性，已有的研究表明许多化学品的致突变、致畸、致癌效应是与,DNA,加合物的形成有关。,DNA,加合物既可作为环境毒性物质靶向暴露剂量的生物接触标志物，为分析致化学毒害物质的暴露提供手段，又可以作为遗传毒性和致癌作用的生物效应标志物，为生物体的致癌风险评价提供重要信息。,4,2.,检测原理,检测的基本过程是，首先对样品,DNA,进行水解，然后对水解的核苷酸进行非选择或选择性,32,P,标记，最后进行分离和测定。因为生物体内加合物的含量极低，要求检测灵敏度大于,0.1-1,个,/10,8,核苷酸，至少能检测到每,10,8,核苷酸中有,1,个加成物的水平。,5,DNA,MN+SPD P,1,+PAP,Xp+Np XpN+N,-,32,PATP,固,/,液相抽提,-,32,PATP,P,1,/S,1,T,4,激酶,*pXp,+*pNp Xp+N Xp *pXpN,TLC T,4,激酶,-,32,PATP VPD,测定,*pXp *pX,+pN,标准法或 核酸酶,P,1,顶醇抽提,/,二核苷酸,/,限量,AIP,法 富集法,HPLC,富集法,5,-,单核苷酸,32,p,后加成,DNA,加成物的检测方案,如图。,6,符号表示,图中,X,表示加合核苷酸，,N,表示正常核苷酸，左边的磷酸,P,表示,5,端，右边的表示,3,端。,酶及特性,酶,特性,微球菌核酸酶（,Micrococcal,Nuclease,，,MN,）,是一种内切核酸酶，作用于单链及双链核酸，生成,3-,磷酸末端。对单链核酸的作用较好，能较好地分解,DNA,或,RNA,的富含,AT,或,AU,区域。本酶催化作用不需要,Mg,2+,，但需要,Ca,2+,的存在。,脾脏磷酸二酯酶,(spleen phosphodiesterase,，,SPD),是把具有,5-OH,末端的,DNA,、,RNA,从,5-,末端向,3-,端进行逐步降解游离出,3-,核苷酸的酶。,7,酶,特性,核酸酶,P1,（,NucleaseP1,）,是一种磷酸二酯酶，具有二酯酶或单酯酶两重活性，即一是作用于,DNA,单链中的,3,5,-,磷酸二酯键，生成,5,-,核苷酸；二是,3,分解单核苷酸或寡聚核苷酸中的,3-,磷酸单酯键。检测中利用了其可以水解正常单核苷酸上的,3,-,磷酸,但难以水解含较大体积加合物的单核苷酸上的,3,-,磷酸,随后加合的加合的核苷酸可以被,T,4,多核苷酸激酶进行,5,-,32,P,标记，而正常的则不能。,前列腺酸性磷酸酶,(prostatic acid,phosphatase,，,PAP,),可以使脱去单核苷酸或二核苷酸,5,的磷酸。,T,4,多核苷酸激,T4 Polynucleotide Kinase,够催化,P,在,ATP,的,位置和多核苷酸（单链、双链的,DNA,、,RNA,）,5,羟基末端和核苷,3,单磷酸核苷之间的转移与交换。,8,2.1,基本方法,1,）,标准方法,将,DNA,用微球菌内切酶（,MN,）及脾磷酸二酯酶（,SPD,）消化成单核苷酸（,Xp+Np,）。,T,4,多聚核苷酸激酶（,PNK,）催化,-,32,pATP,中的,32,p,至单核苷酸的,5,末端（,*,pXp+*pNp,）。,以,PEI-,纤维素薄层层析分离,用放射自显影定性。,用液闪测定进行定量。,9,2,）限量,ATP,法,在标记反应中不再加入过量的而限制加入,ATP,的量，由于对加合物核苷酸的标记优于正常核苷酸，从而提高了灵敏度。,3,）丁醇富集法,在,DNA,样品被消化成,3,-,单核苷酸后，加入丁醇及反相试剂四丁基氯化铵，在酸性的条件下抽提富集的加合核苷酸，然后再进行标记。,10,4,）核酸酶,P1/S1,富集法,在进行,32,P,标记前，用核酸酶,P1,或,S1,处理,3,-,单核苷酸，正常,3,-,单核苷酸可以被核酸酶,P1,去磷酸化,而不为,T,4,多聚核苷酸激酶作用,但核酸酶,P1,不能使,3,-,加合的核苷酸去磷酸化,这样在进行标记时就只有其被标记上,32,P,。,5,）,HPLC,富集法,利用,HPLC,分离,DNA,的消化混合液,富集被加合的核苷酸,然后进行标记,进而用薄层色谱分离测定。,11,6,）二核苷酸,/5-,单磷酸法,首先在酸性条件下（,PH5.0,）,加入核酸酶,P1,DNA,分子中的正常核苷被水解成,5,-,单磷酸核苷,(pN),而被加合的核苷则由于结构改变而对该酶不敏感,其消化产物是,5,-,磷酸二核苷酸,(pXpN),。,然后加入前列腺酸性磷酸酶,(PAP),5,-,单磷酸核苷,(pN),被进一步酶解成核苷,(N),而,5,-,磷酸二核苷酸,(pXpN),则被酶解成二聚核苷,(XpN),。,最后再加入,-,32,pATP,与,T4,激酶进行标记，被加合的二聚核苷,(XpN),被标记为,32,pXpN,而正常核苷,(N),不被标记。,也可以再加入蛇毒磷酸二酯酶,进一步将,32,pXpN,酶解成单核苷,32,pX,和,pN,然后进行分离测定。,12,2.2,方法比较,32,p,后标记法的优点是灵敏度高，不需要复杂的仪器设备，缺点是特异性和稳定性差、步骤繁琐、不能提供结构信息等。,方法,灵敏度,应用特点,标准法,1000,32P,标记效率及灵敏度较低，目前已很少应用。,限量,ATP,法,0.1,1,提高了灵敏度，但重现性较差，一般用于加合物不能富集的情况。,丁醇富集法,0.01,0.1,灵敏度很高，广泛应用，但对不同种类的加合物的富集效率不同。,核酸酶,P1,0.01,0.1,灵敏度高，操作简便，重现性好，广泛应用，但某些加合核苷亦对核酸酶,P1,敏感。,HPLC,富集法,0.1,1,能将复杂成分的加合物分开，进行定性定量分析，但背景值较高。,选择标记法,0.01,灵敏度高，特别用于富集法回收不完全的情况，为最广泛应用的方法。,13,3.,操作过程,3.1,标准方法,DNA,的酶解过程为，取一份含,2.5,gDNA,样品的溶制溶液，置,1ml,聚丙烯离心管用真空离心蒸发器蒸干，然后用含,5,g,（,0.6u,）,微球菌核酸酶（,micrococcal nuclease,）,和,5,g,脾磷酸二脂酶（,spleep phosphodiesterase,）的,12,l 10mM,CaCl,2,，,20mM,琥珀酸缓冲液（,PH6.0,），在,37,0,C,下消化,3h,。,参见：,32,P-Postlabeling,Analysis of Aromatic DNA Adducts in Fish from Polluted Areas1. Cancer Research 47, 6543-6548. December 15, 1987,14,3.2,丁醇富集,DNA,消化,同标准方法，取,5,g DNA,和各,5,g,微球菌核酸酶（,Micrococcal Nulease),和脾磷酸二脂酶（,spleen phosphodiesterase,）,置,12.5,l 10mM,琥珀酸缓冲液（,pH6.0,）,:,5mM CaCl,2,，在,37,0,C,下消化,3h,然后被稀释成,50,l,。,DNA,富集,取,1,g,10,l DNA,消化液，与,5,l,100mM,甲酸铵（,pH3.5,）和,5,l,10mM TBA,，及,30,l,的水，置,1.5ml,的微量离心管，用等体积的丁醇提取两次，混合液涡旋,30,秒后用台式离心机离心,1min,进行分离，合并提取液并用,90,l,水反相萃取,2,次，以除去正常核苷酸的污染，最后丁醇提取液加,1,l 200mM,Tris-HCl,（,pH9.5),进行中和。,参见：,Enhanced Sensitivity of 32P-Postlabeling Analysis of Aromatic Carcinogen:DNA Adducts. Cancer Research 45, 5656-5662, November 1985,15,3.3,酶,P1,富集,取,12.5,gDNA,，与,750mU,微球菌核酸酶,，,12.5mU,脾脏磷酸二酯酶，在,12.5,l,的缓冲液（,20mM,琥珀酸钠，,8mMCaCl,2,，,pH6.0,），于,37,0,C,温育,3h,，移取,2.5,l,水解液，进行,1:1500,倍稀释用以测定正常核苷酸的含量，对于核酸酶,P1,方案，取,10,l,水解液，加,3,l,含,5,g,（,5U,）核酸酶,P1,的缓冲液（,0.8M NaAc,（,pH5.0,），,2mM ZnCl,2,），在,37,0,C,水浴,30min,后，用,3,l 427mM,tris base,中止反应，然后如前法用丁醇抽提，最后加,4,l,标记混合液（,400mM,N,-,二（羟基）甘氨酸（,pH9.5,），,300mM,二硫苏糖醇，,200mM MgCl,2,，,10mM,亚精胺，,100,Ci-,32,pATP,（,15pmol,），,0.5,l 90,M ATP,，,10U T4,多核苷酸激酶），在室温下水浴,30min,，,20,l,被用于聚乙烯亚胺包被纤维素板薄层层析，并用储磷屏检测和定量。,16,参见：,DNA adduct formation from quaternary benzocphenanthridine alkaloids sanguinarine,and chelerythrine as revealed by the,32,P-postlabeling technique. Chemico-Biological Interactions 140 (2002) 231242.,3.4,选择标记,取,3,g DNA,，加入,0.5,l Nu.P,（,1,g/l,），,1,lPAP,（,100U/,l,），,0.5,l,缓冲液（,88mM NaAc,，,0.5mM,ZnCl,2,，,pH5.0,）置,38,0,C,水浴,90min,，加,0.7,l 1M CHES-NaOH,（,pH9.5,）终止反应，取,1,l,水解液，溶于,300,l 10mM Tris-HCl,（,pH7.5,）中，测定,OD,260,值用于计算总核苷酸的浓度。在剩余的,4.7,l DNA,水解液中，加入,0.5,l PNK,（,10U/,l,），,1.3,l-32pATP(10-15Ci),，,0.7,l 10PNK,缓冲液（,0.1M Bicinc-NaOH,，,0.1M MgCl,，,0.1M,二硫苏糖醇，,10mM,精脒，,pH9.5,），置于,38,0,C,水浴,90min,，然后加入,1.7,l APy,（,11mU/,l,）进一步水解,30min,，用以水解多余的,ATP,，最后取,6,l,标记混合液用,TCL,定性和定量。,17,参加：建立只标记加成碱基的,3 2 P,后标记法以用于检测致癌物一,D N A,加成物,.,癌变,崎变,突变,1 993,，,5,（,4,）：,31-35,定性,根据放射性自显影结果，确定加成物斑块数目和相对含量。,定量,其中，,SP,ATP,是,32,p-ATP,的比活度（,cpm/pmol,）,G,是实验,DNA,的用量（,g,），常系数,3240,是每,1,gDNA,相当于,3240 pmol,的单核苷酸。,参见：,32,p,后标记法测定,DNA,加合物,.,环境化学，,1994,，,13(3),：,272-278,18,