09.第九章 维生素类药物的分析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,赵春杰,沈阳药科大学药分教研室,第九章维生素类药物的分析,维生素：维持人体正常代谢功能,所必需的生物活性物质,Ch.P2005:V,A,，,B,1,，,B,2,，,B,6,，,B,12,，,C,，,D,2,，,D,3,，,E,，,K,1,叶酸、烟酰胺等原料及制剂共,40,多种。,维生素分类：,水溶性：,B,族，,C,脂溶性：,A,，,D,，,E,，,K,等,概述,主要内容,维生素,E,的分析,维生素,D,的分析,维生素,B,1,的分析,维生素,C,的分析,维生素,A,的分析,（一）结构与性质,1,、结构,环己烯 多烯醇（共轭双键系统）,R=H,V,A,醇,(,维生素,A,1,),：性质活泼,R=CH,3,CO-,V,A,醋酸酯：性质稳定,一、维生素,A,的分析,2,、物理性质,淡黄色或红色油状或固定物，几乎无气味，不溶于水，易溶于氯仿，乙醚，环己烷和油中,V,A,醇：,max,(,异丙醇,)325nm,V,A,酯：,max,(,环己烷,)328nm,一、维生素,A,的分析,3,、化学性质,日光照射裂解,空气、氧化剂、加热或金属离子等,产生环氧化物、醛、酸,三氯化锑反应,蓝色产物（不稳定）、渐变成紫红色,一、维生素,A,的分析,（二） 鉴别,1,、,Carr-price,反应（三氯化锑）,三氯化锑的氯仿液与,V,A,作用产生蓝色,渐变成紫红色,无水：三氯化锑水解、,V,A,不溶,无醇：乙醇能和反应中正碳离子作用,一、维生素,A,的分析,2,、紫外法,本品加无水乙醇盐酸溶解，立即紫外扫描,326nm,单一吸收峰,(V,A,),水浴加热,30s,，迅速冷却，再扫描,348,、,367,和,389nm,三个尖锐吸收峰,(,去水,V,A,),一、维生素,A,的分析,（三）含量测定,紫外法（三点校正法）,Morton,和,Stubb,（,Analyst,，,1946,，,71:348,）,一、维生素,A,的分析,1,、维生素,A,中存在的相关物质和不相关物质,1,）衍生物,维生素,A,2,（去氢维生素,A,） 维生素,A,3,（去水维生素,A,）,一、维生素,A,的分析,2,）异构体,目前分离得到,5,个异构体,新维生素,Aa(2-,顺型,),新维生素,Ab(4-,顺型,),一、维生素,A,的分析,一、维生素,A,的分析,新维生素,Ac(2.4-,顺型,),异维生素,Aa(6-,顺型,),异维生素,Ab(2.6-,二顺型,),3,）氧化产物：环氧化物，醛，酸,4,）中间体、副产品：,5,）裂解产物：,6,）鲸醇（,Kitol,）,:,二聚体，非生物活性,7,）不相关物质：抗氧剂，稀释用油,在,325,328nm,处均有吸收,不相关吸收或背景吸收,一、维生素,A,的分析,2,、原理,1,）维生素,A,最大吸收波长附近（,310,340nm,）,杂质吸收近似一条直线,2,）物质吸收光谱的加和性,A,总,=,A,VA,+A,杂质,一、维生素,A,的分析,3.,三点选择,一、维生素,A,的分析,维生素,A,醇,1,),三点：,325,、,310,、,334nm,2,),等吸收点：,A,310,=A,334,=,3,）校子公式：,A,325,（校正）,=6.815A,325,-2.555A,310,-4.260A,334,一、维生素,A,的分析,维生素,A,酯,1,）三点：,328,、,316,、,340nm,2,）波长等距：,12nm,3,）校正公式：,A,328,（校正）,=,3.52(2A,328,-A,316,-A,340,),一、维生素,A,的分析,4.,校正公式的应用及含量计算,第一法,:,样品,9,1,5IU/ml,环己烷溶液,max326,329nm,300,、,316,、,328,、,340,、,360nm,（,A,1,、,A,2,、,A,3,、,A,4,、,A,5,),计算吸收度比值,(,A,1,/A,3,、,A,2,/A,3,、,A,3,/A,3,、,A,4,/A,3,、,A,5,/A,3,),计算比值差,一、维生素,A,的分析,吸收度比值规定值,一、维生素,A,的分析,波长（,nm,）,300,316,328,340,360,吸收度比值,（规定）,0.555,0.907,1.000,0.811,0.299,max,吸收度比值范围,Amax,含量（效价）,326329, 0.02,Amax(,不须校正,),326329, 0.02, 3%,-3% -,15%,+3%,第二法,不在,326329,第二法,第二法：,a,、,max,不在,326,329nm,b,、校正与未校正吸收度比较,+3%,样品：,9,15IU/ml,一、维生素,A,的分析,max,323,327nm,之间,300,、,310,、,325,及,334nm,A,300,/A,325,0.73,，计算,A,325,（校正）,a,、校正在未校正吸收度,土,3%,以未校正吸收度计算,b,、,土,3%,，以校正吸收度计算,一、维生素,A,的分析,max,不在,323,327nm,或,A,300,/A,325,0.73,需进一步纯化,一、维生素,A,的分析,5.,生物效价和换算因子,（,Biological potency and conversion,factor,CF,）,1IU=0.344g,V,A,醋酸酯,1IU=0.300g,V,A,醇,1g,V,A,醋酸酯,:2.907,10,6,IU/g,1g,V,A,醇,:3.33,10,6,IU/g,一、维生素,A,的分析,一、维生素,A,的分析,换算因子：,单位百分吸收系数所相当于的效价,V,A,酯百分吸收系数,=1530,V,A,醇百分吸收系数,1820,CF,(,酯,)=2.907,10,6,/1530=1900,CF,(,醇,)=3.33,10,6,/1820=1830,一、维生素,A,的分析,6,.,注意问题,仪器波长校准,半暗室快速进行,一、维生素,A,的分析,dl-Tocopheryl,Acetate,消旋,-,生育酚醋酸酯,黄色油状液体，不溶于水，易溶于有机溶剂,天然,V,E,右旋体，合成为消旋体,与生殖功能有关的一类维生素总称,二、维生素,E,的分析,(,一,),结构分析,二、维生素,E,的分析,1.,苯骈二氢吡喃、,C,6,位乙酰化的酚羟基,2.,紫外吸收,3.,旋光性,(,二）鉴别,1,、本品,无水乙醇溶解,硝酸，,75,加热,鲜红色，逐渐转为橙红色。,二、维生素,E,的分析,2,、本品,醇制,KOH,，煮沸,游离生育酚,乙醚提取,联吡啶、三氯化铁乙醇液,深红色,二、维生素,E,的分析,二、维生素,E,的分析,（三）含量测定,铈量法：硫酸铈氧化,荧光法：硝酸氧化，与邻苯二胺络合,比色法：,Fe,3+,氧化，与联吡啶络合,GLC,法：,BP,USP,Ch.P,HPLC,法：,JP,二、维生素,E,的分析,1,、气相色谱法：,Ch.P,（,2005,）,1,）色谱条件及溶液配制,色谱柱：不锈钢柱或玻璃填充柱,载体：硅藻土或高分子多孔小球,固定液：,2% OV-17,（硅酮）,柱温：,265,检测器：,FID,二、维生素,E,的分析,内标溶液：,正三十二烷（,1.0mg/ml,正已烷溶液）,标准溶液：,V,E,对照品溶于内标中，,2mg/ml,样品溶液：,V,E,样品溶于内标中，,2mg/ml,二、维生素,E,的分析,2,）系统适应性试验,（,1,）分离度：与内标峰,R,2,t,R1,、,t,R2,相邻峰保留时间,W,1,、,W,2,相邻峰峰底宽,（,2,）柱效：,V,E,峰,n500,W,h/2,(Y,1/2,),半,(,高,),峰宽,二、维生素,E,的分析,（,3,）拖尾因子：,W,0.05h,为,0.05,峰高处峰宽,T=0.95,1.05,二、维生素,E,的分析,（,4,）相对标准差：,80%,、,100%,和,120%,对照品溶液,分别进样,3,次,计算平均校正因子,RSD,2.0%,二、维生素,E,的分析,3,）、测定,校正因子,取标准溶液，,13l,进样,As,、,ms,内标物峰面积、内标物质的量,Ar,、,mr,对照品峰面积、对照品的量,二、维生素,E,的分析,样品的测定,取样品溶液，,13l,进样,A,s,、,m,s,内标物峰面积、内标物质的量,Ai,、,mi,样品峰面积、样品的量,二、维生素,E,的分析,2,、高效液相色谱法,JP(14),1,）色谱条件,色谱柱：,15cm,30cm,4mm,不锈钢柱,固定相：,5m,10m ODS,流动相：甲醇,-,水（,49,：,1,）,检测器：,292nm,二、维生素,E,的分析,2,）系统适应性试验,分离度：,生育酚与醋酸生育酚分离度,R,2.6,峰高的,RSD,小于,0.8%,二、维生素,E,的分析,3,）测定,维生素,E,样品与对照品,分别用无水乙醇溶解,进样,20ul,以峰高计算,二、维生素,E,的分析,（一）结构与性质,抗佝偻病维生素的总称,至少十多种，均属甾醇衍生物,三、维生素,D,的分析,三、维生素,D,的分析,D,2,比,D,3,多一个双键和一个甲基。,（,1,）脂溶性维生素,（,2,）旋光性,:D,2,有,6,个、,D,3,有,5,个手性,C,（,3,）不稳定性,:,遇光、空气及氧化剂变质,（,4,）显色反应,:,与强酸反应,（,5,）紫外吸收,三、维生素,D,的分析,（二）鉴别,1,、显色反应,（,1,）醋酐,-,硫酸反应,D,2,、,D,3,氯仿溶解,醋酐和硫酸,振摇，呈色,三、维生素,D,的分析,（,2,）三氯化锑反应,D,2,、,D,3,1,2,二氯乙烷溶解,三氯化锑试液,橙红色，逐渐变为粉红色,三、维生素,D,的分析,2,、,D,2,、,D,3,区别,本品,10mg,溶于,96%,乙醇,10ml,中,取出,0.1ml,加乙醇,1ml,和,85%,硫酸,5ml,D,2,显红色，,max,570nm,D,3,显黄色，,max,495nm,三、维生素,D,的分析,（三）含量测定,USP:,化学法、色谱法和微生物法,BP:,化学法、光谱法和色谱法,Ch.P:,正相色谱法,三、维生素,D,的分析,2,）测定,第一法：无维生素,A,及其他干扰,第二法：有干扰（皂化提取）,第三法：第二法不能消除干扰的,（柱分离）,三、维生素,D,的分析,（一） 结构分析,盐酸硫胺（,Thiamine,hydrochloride,）,C,12,H,17,ClN,4,OS,HCl=337.27,四、维生素,B,1,的分析,1,氨基嘧啶,次甲基,噻唑环,2,噻唑环,碱性下,/,氧化剂,硫色素,3,N,杂环,生物碱沉淀试剂,4,碱性中心,非水滴定,5,盐根,硝酸银,6,V,B1,NaOH/,加热,Na,2,S,加入醋酸铅,7,紫外吸收,四、维生素,B,1,的分析,（二）鉴别,1,、硫色素反应,V,B1,铁氰化钾,/OH-,硫色素,硫色素,溶于正丁醇,(,蓝色莹光,),酸性，莹光消失,碱性，莹光复现,四、维生素,B,1,的分析,2,、沉淀反应,碘化汞钾,黄白色,碘试液,红色,硅钨酸,白色,四、维生素,B,1,的分析,3,、加碱分解后与醋酸铅反应,V,B1,+Pb(Ac),2,+NaOH,加热,黄色、棕色、黑色,+,HCl,H,2,S,+,Pb(Ac),2,四、维生素,B,1,的分析,(,三,),含量测定,硅钨酸重量法,非水碱量法,银量法,络合量法,硫色素莹光法,比色和分光度法,四、维生素,B,1,的分析,1,、非水滴定法（原料药）,V,B1,冰醋酸溶解、醋酸汞,喹哪啶红,-,亚甲蓝混合指示剂,0.1mol/L,高氯酸滴定,化学计量关系,1,：,2,滴定前：醋酸汞,四、维生素,B,1,的分析,2,、紫外法（片剂、注射剂）,V,B1,溶于盐酸（,91000,）,max,246nm,421,四、维生素,B,1,的分析,L-,抗坏血酸,白色结晶或粉末，味酸,易溶于水，稍溶于乙醇，不溶乙醚,推荐的日允许量：,婴儿,35mg,，儿童,45mg,，成人,50,60mg,五、维生素,C,的分析,(,一）,结构分析,1,、糖类十分相似,五、维生素,C,的分析,2,、强还原性,二烯醇结构,五、维生素,C,的分析,3,、酸性,C,3,位羟基,pK,a1,4.17,C,2,位羟基,pk,a2,11.57,.,4,、紫外吸收,0.1mol/L,HCl,溶液,245nm,中性溶液,265nm,五、维生素,C,的分析,5,、水溶液不稳定性,微量,Cu,2+,氧化加速,pH7,自氧化,6,、旋光性,C,4,、,C,5,手性碳,0.1g/ml,水溶液比旋度,+20.5,+,21.5,五、维生素,C,的分析,(,二）鉴别,1,、利用其还原性,硝酸银（银镜）,2.6-,二氯靛酚,(,褪色）,高锰酸钾（褪色）,亚甲蓝（蓝色褪去）,磷钼酸（钼蓝）,斐林氏溶液（红色氧化亚铜）,五、维生素,C,的分析,（,1,）与硝酸银反应,本品,加水溶解,加硝酸银试液,银黑色沉淀（,Ch.P,、,BP,采用）,五、维生素,C,的分析,（,2,）,2,，,6,二氯靛酚反应,本品,加水溶解,2,6,二氯靛酚试液,颜色消失（,Ch.P,采用）,五、维生素,C,的分析,2,、糖类的性质,三氯醋酸或盐酸存在下（酸性下水解）水解、,脱羧、失水转变为糠醛，加入吡咯，温热作用生,成蓝色。,五、维生素,C,的分析,(,三）含量测定,1,碘量法,操作：本品，加新沸过冷水,100ml,与稀,HAc10ml,的混合液,淀粉指示剂,立即用,0.05mol/LI,2,滴定,（,8.806mg/ml C,6,H,8,0,6,=176.12,）,原理：,Vc,+ I,2,去氢抗坏血酸,+,2HI,五、维生素,C,的分析,注意事项：,1,）新沸冷水，减少水中溶解氧影响,2,）在酸性溶液中（,HAC,、,H,2,SO,4,、偏磷酸）,Vc,相对稳定,3,）,Vc,注射剂亚硫酸盐抗氧剂,滴定前加丙酮或甲醛,五、维生素,C,的分析,2,2,6-,二氯靛酚法,氧化型酸性介质中红色，还原型无色,终点，微过量氧化型而呈玫瑰,无需另加指示剂,五、维生素,C,的分析,注意事项：,1,）专属性，片剂、注射剂、多种维合剂,2,）标准液分解，不稳定，需经常标化,3,）,USP,、,JP,测定维,C,片、注射液,五、维生素,C,的分析,