资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍,/,苯酚法,原理：,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；,释放出来的,DNA,和,RNA,由于在特定,pH,下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离,；,有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净,RNA,。,1,异硫氰酸胍,/,苯酚法,步骤,:,材料准备：,尽量新鲜。,裂解变性,：,异硫氰酸胍,（,亚硫氢胍，巯基乙醇，,N-,月桂肌氨酸等）。,使细胞及核蛋白复合物变性，释放,RNA,，,有效抑制核酸酶。,纯化分离：,苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚,/,氯仿可抽提去除杂物。,洗涤：,70,乙醇。,沉淀：,异丙醇、无水乙醇。,乙酸钠（,pH4.0,）：,维持变性的细胞裂解液的,pH,值，沉淀,RNA,。,此外还常用氯化锂选择沉淀,RNA,。,RNA提取的通用方法,2,影响RNA提取的因素,材料,：,新鲜，切忌使用反复冻融的材料,如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在,TRIzol,或,样品贮存液中，于,70,或,20,保存,如要多次提取，请分成多份保存,液氮长期保存，,70,短期保存,3,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解,：,根据不同材料选择不同的处理方法：,培养细胞：,通常可直接加裂解液裂解,酵母和细菌：,一般,TRIzol,可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁,动植物组织：,先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻,样品量适当，保证充分裂解,为减少,DNA,污染，可适当加大裂解液的用量,4,纯化：,在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；,经典的纯化方法，如,LiCl,沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成,RNA,降解；,柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响,RNA,后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响RNA提取的因素,5,RNA提取常见问题,RNA,的降解,OD,260,/OD,280,比值偏低,电泳带型异常,下游实验效果不佳,6,RNA降解,新鲜细胞或组织,：,裂解液的质量,外源,RNase,的污染,裂解液的用量不足,组织裂解不充分,另外某些富含内源酶的样品,(,如脾脏，胸腺等,),，很难避免,RNA,的降解。,建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液,。,7,RNA降解,冷冻样品：,样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至,-70,冰箱保存。样品要相对小一点；,先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；,样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,8,OD,260,/OD,280,比值偏低,蛋白质污染：,不要吸入中间层及有机相,，,加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,减少起始样品量，确保裂解完全、彻底,解决办法,:,重新抽提一次，再沉淀，溶解。,苯酚残留：,不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,解决办法,:,重新抽提一次，再沉淀，溶解。,9,OD,260,/OD,280,比值偏低,抽提试剂残留：,确保洗涤时要彻底悬浮,RNA,，,并且彻底去掉,75%,乙醇。,解决办法,:,再沉淀一次后，溶解。,设备限制：,测定,OD260,及,OD280,数值时，要使,OD260,读数在,0.10 - 0.50,之间。此范围线性最好。,用水稀释样品：,测,OD,时，对照及样品稀释液请使用,10,mM,Tris,，,pH 7.5,。,用水作为稀释液将导致比值的降低。,10,电泳带型异常,非变性电泳：,上样量超过,3ug,，,电压超过,6V/cm,，,电泳缓冲液陈旧，均可能导致,28S,和,18S,条带分不开。,变性电泳条带变淡：,EB,与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；,甲醛的质量不高,。,11,下游实验效果不佳,RNA,降解,抽提试剂的残留,75%,乙醇洗涤,样品中杂质的残留,多糖等杂质，再次沉淀,DNA,污染,使用,RNase,-Free,的,DNase,I,消化抽提,RNA,12,RT常见问题分析和解决方案,问题一：,少量或没有,RT-PCR,产物,RNA降解,分离无污染，高质量的RNA；防止RNA降解,RNA中含逆转录酶抑制剂,70（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂,起始RNA量太低,增加RNA的量,多糖同RNA共沉淀,用氯化锂沉淀RNA以除去多糖,合成cDNA第一链合成的引物退火失败,确定退火温度适合所用的引物,RNA模板存在较多二级结构,将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，提高逆转录反应温度,反转录成功，PCR失败,PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物,可能原因,解决方案,13,RT常见问题分析和解决方案,问题二：,有非特异性带,引物和模板的非特异性退火,基因特异性引物设计较差,RNA,中有基因组,DNA,的污染,形成引物二聚体,镁离子浓度太高,提高反应的温度和特异性,提高引物的特异性,使用扩增级DNase处理RNA,设计在3端没有互补序列的引物,优化镁离子浓度,可能原因,解决方案,14,RT常见问题分析和解决方案,问题三：,产生弥散（,smear,）条带,第一链产物的含量过高,PCR,反应中引物过多,循环数过多,退火温度过低,寡核苷酸片段产生的非特异性扩增,常规,PCR,步骤中减少第一链产物的量,减少引物的用量,减少PCR的循环次数,提高退火温度,提取高质量RNA，防止被DNA污染,可能原因,解决方案,15,
展开阅读全文