酿酒酵母的大规模液体发酵生产课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物工程综合实验,实验 酿酒酵母的大规模液体发酵生产,实验原理,本实验通过对,15,升中型发酵罐的了解及使用，将整个微生物发酵生产过程分成几个阶段，系统的表现了发酵生产工艺流程，包括使用发酵设备前期整个设备给水、给无菌空气、给高压蒸汽管路及其排放管路的了解，以及在实际操作过程中各个管路之间的切换，发酵用各个检测设备的标定。并以酿酒酵母的纯化培养开始、再进行摇瓶放大、最后实现发酵罐的发酵生产的具体实验过程，让学生学会在发酵过程中能够分阶段的进行采样检测，根据检测值对发酵的条件进行必要的调节，最后对于发酵所得到的产物进行必要的分离纯化，制成成品并保存，从而掌握整个发酵生产工艺流程的具体实施过程。,实验简介,15,升发酵罐图示,发酵罐罐路示意图,空气流量计,电加热器,冷凝管,空气,水,蒸气,A03,A02,A01,S03,S01,S02,VT1,V01,P02,W01,C01,W03,W02,罐体,管路说明,一、空气及其净化,来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气预过滤器）进入发酵罐空气总管，空气流量计,A01,、阀,A02,、单向阀、空气过滤器、阀,A03,到达反应器内，尾气经阀排出，本管路具有计量、净化作用。注：空气流量级显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。,二、蒸汽,蒸汽进夹套,蒸汽经阀,S01,进入夹套（上进），经阀,V01,排出冷凝水。蒸汽对培养基预热。,蒸汽进反应器,蒸汽经阀,S02,、单向阀、空气过滤器、阀,A03,进入罐内，由排气口控制阀,VT1,排出。蒸汽对过滤器及空气管线消毒。,蒸汽进取样阀及放料阀,蒸汽经阀,S03,进入取样阀，由阀,P02,排出冷凝水。蒸汽对取样阀及底阀灭菌。,三、自来水,自来水进夹套,当电磁阀,C01,打开时，自来水经自动注水阀、阀,W01,进入反应器夹套（下进），由夹套上口、阀,W02,、加热器、电磁阀,C01,排出；当电磁阀关闭时，夹套水经,W02,进入电加热器、循环泵、单想阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。注：温度自动前必须对夹套注水,自来水进排气冷凝器,自来水经阀,W03,进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发。,实验步骤,葡萄糖,1g,氯化钾,1.8g,酵母浸膏,2.5g,醋酸钠,8.2g,蒸馏水,1000mL,一、发酵前的准备工作,1,酵母菌活化：由种子活化到试管斜面上。,2,按照下列配方配制麦氏（,Meclary,）培养基,300ml,，,113,灭菌,20min,。,将,300ml,种子培养液分成两份，无菌操作取酿酒酵母菌斜面菌苔，接种于种子培养液，摇床培 养,24,48,小时。,3,补料液的配制及灭菌：配制,0.2mol/L NaOH,溶液、,0.6mol/L HCl,溶液、食用油分别装入补料瓶中，将连在补料瓶上的橡皮管，用绳子扎紧，,121,灭菌,20min,。,4,培养基的制备：酵母膏,25g,、,NaAc82g,、,KCl 18g,、葡萄糖,10g,。加水溶解搅拌均匀。,5,溶氧电极标定：,零点标定：将电极拔出浸没于饱和的无水亚硫酸钠溶液中，待电极显示值稳定后标零点,1,。斜率标定：溶氧电极的斜率（满度）标定一般在发酵之前，温度、罐压、通气量均在正常情况下进行，一般以,100,标定，因为它是个相对值，也可以是其他数值，罐压对溶氧量影响较大，标定时应保持罐压相对稳定。,6,pH,电极标定：,pH,电极零点和斜率不能在发酵状态下标定，只能在灭菌以前进行，但可以在发酵过程中进行零电位补偿。标定前电极需泡于液体中并已联机,1,小时以上，通常采用两点标定法：先将电极洗净擦干，然后浸入,6.86,缓冲液，并将零点标定值设为,6.86,，然后按开始标定键，待,pH,显示值稳定后可按零点标定结束键，然后洗净擦干电极后同样方法标定斜率，然后再标定零点，反复至更换缓冲液时，,pH,未经标定已达标准值（附近）即可。,7,蠕动泵流量标定,蠕动泵的标定随时可以进行。可以对酸、碱泵、补料泵、消泡剂泵进行标定，方法相同。先取定量的液体，安装好，然后在标定画面上设为标准容量。然后将手、自动开关调节到手动位置，使泵运转并将管内空气排出开始滴液，将出口液体滴入标准容器，同时按标准开始键并确定，此时开始以秒为单位计数，待输出液体到达设定的标准容量时，再按确定。整个标定过程结束。此时，加料速度便由控制器显示出来。标定结束后将开关置于“关”的位置。,8,将,4,步骤配制好的培养基加入发酵罐中，加水至体积约,11.5,升（防止水蒸发过多）。,二、实罐灭菌操作,1,、准备,盖紧罐盖上的各种盖帽，旋紧罐盖上的压紧螺栓，,关紧发酵罐底阀,P01,，倒入培养基，调整,pH,值，旋紧接种口。,关排气冷凝器进水,W03,，移去进出口的软管排尽冷凝水夹套中的水,2,、培养基预热,准备工作,预先启动蒸汽发生器及空气压缩机。,将控制器中的温度控制设定为手动,开排气阀,VT1,，关闭其他所有阀们,开排气阀,VT1,，开夹套冷凝水阀,V01,排夹套水，关闭其他阀门。,启动反应器搅拌马达。调节转速,200-300rpm,。,蒸汽进夹套：缓慢开夹套蒸汽阀,S01,蒸汽进夹套（注意：此时有轻微爆破声属正常，如声音过响，则开阀速度应减慢）。待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀,V01,，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可。并控制夹套内压力不要超过,0.2MPa,。当培养基预热至,98,时，进入实罐灭菌操作。在培养基温度在,80-90,时可以适当的减慢升温速度，在本温度区域可以杀灭大部分微生物。,蒸汽进取样阀：开出料阀,P02,（关紧底阀,P01,），开蒸汽阀,S03,，蒸汽进入取样阀内腔，当阀,P02,排尽冷凝水后应调节其开度，以少量蒸汽排出即可。,3,、实罐灭菌,蒸汽进过滤器：停搅拌，微开过滤器上排冷凝水阀,V02,，开过滤器前蒸汽阀,S02,，微开过滤器后排冷凝水阀,V03,，缓缓开切断阀,A03,，蒸汽经过过滤器进入反应器，当冷凝水阀,V02,、,V03,出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀,V02,、,V03,以有少量蒸汽排出为宜。当排气口有蒸汽排出或罐温到达,100,两分钟后，关闭排气阀,VT1,。调节切断阀,A03,和蒸汽阀,S02,，维持过滤器前蒸汽压力为,0.12-0.16MPa,，同时必须保证切断阀有一定开度，不得关死。当罐温达到,100,时，培养基中的溶氧接近零，可以标定溶氧的零点。,当达到预定温度或罐压，开排气阀,VT1,至有少量蒸汽排出，关紧或微开夹套蒸汽阀,S01,，微开底阀,P01,（开阀时观察视镜处培养基翻腾的变化，以有少量变化为宜），根据罐压或罐温变化的趋势。及时调节蒸汽阀,S02,、,S03,。阀门调节应微调，避免大幅度开关。当反应器罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。,保温开始后，排气阀蒸汽排量不宜太小，否则可能导致液面以上的罐体部分尤其罐盖达不到消毒温度。,保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸汽冒出。,4,、灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）,保温结束后首先旋紧接种口盖。旋紧罐底阀,P01,，再关紧取样器的蒸汽阀,S03,。,关紧空气管线切断阀,A03,及冷凝水阀,V03,，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀,A01,、,A02,，开冷凝水阀,V03,用空气吹过滤器，当罐压接近,0.05MPa,时关闭阀,V03,，缓缓开空气管线切断阀,A03,，空气进入发酵罐。当过滤器冷凝水阀,V02,排尽冷凝水后就可以关闭,关夹套蒸汽阀,S01,、冷凝水阀,V01,，开夹套进水阀,W01,和循环管线切断阀,W02,。在控制器中将温度控制方式设定为“自动”，发酵罐进入自动降温阶段。按下搅拌开关，设定搅拌转速并“自动”控制。,在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力掉零。当温度到达工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量、罐压、标定溶氧电极斜率及校正,pH,电极的零点。,三、接种,调节进气量至,300,1000L/h,，开排气阀至罐压接近于,0,（不得大于,0.2kg/cm3,），放松接种口，在火焰保护下打开接种口，迅速将种子倒入，旋紧接种盖，立即调高罐压，在控制器的初始化菜单中设定发酵批号，并开始进行发酵。,四、补料,将灭菌消毒的补料瓶放好，手动安装好输液管，使中间接头嵌在蠕动泵凹槽内,用酒精棉球擦拭罐盖补料口，打开盖后将针头迅速插入并穿透密封盖。,打开蠕动泵手动开关，使料液管中充满料液，置开关为自动。,五、发酵及取样检测,取样器消毒：半开阀,P02,，开蒸汽阀,S03,，蒸汽进入取样器，消毒时间,5-10,分钟。,关蒸汽阀,S03,，全开出料阀,P02,，准备取样。,逆时针转动取样阀,P01,手柄，进行取样。回转手柄。,开蒸汽阀,S03,，冲洗取样器，关阀,S03,。取样结束。,放料 发酵完毕通过取样口放料。,离心 以,5000r/min,，离心,5min,，取下层沉淀。将沉淀反复水洗，至上清颜色变淡,超声波破碎 将沉淀用水溶解后用超声波,3s,间隔,2s,进行,30,次，再离心取上清液，即所有提取的菌体蛋白。,-40,冷冻保存。,使用冷冻干燥机冷冻干燥制得蛋白质干粉。,六、发酵后处理,